新疆山羊皮肤组织中MC1R•Agouti和MITF基因的差异表达研究

摘要 ［目的］研究MC1R、Agouti和MITF基因在不同毛色新疆山羊皮肤组织中的差异表达，为确定其与新疆山羊毛色形成的相关性提供依据。［方法］采用实时荧光定量PCR技术，检测3种不同毛色（白色、褐色、黑色）新疆山羊皮肤组织中MC1R、Agouti和MITF基因mRNA的表达差异。［结果］MC1R、Agouti 及 MITF 基因mRNA在不同毛色新疆山羊皮肤组织中均有表达；MC1R、MITF基因mRNA在黑色新疆山羊皮肤组织中的表达量高于褐色和白色新疆山羊（P>0.05），Agouti基因mRNA在白色新疆山羊皮肤组织中的表达量显著高于褐色和黑色新疆山羊（P<0.05）。［结论］MC1R、Agouti和MITF基因对新疆山羊毛色形成有一定影响，为今后新疆山羊毛色选育与品种改良提供了参考。

关键词 新疆山羊；MC1R基因；Agouti基因；MITF基因；毛色

中图分类号 S 827  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）02-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.02.024

Differential Expression of MC1R，Agouti and MITF Genes in the Skin Tissues of Xinjiang Goats

XU Yan-li， L Xue-feng， CHAI Ting et al

（Quality Standards Institute of Animal Husbandry， Xinjiang Academy of Animal Sciences， Urumqi，Xinjiang  830012）

Abstract ［Objective］ To study the differential expression of MC1R， Agouti and MITF genes in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat color， and provided basis for determining the correlation between the above genes and the color formation of Xinjiang goats.［Method］ By using real-time fluorescent quantitative PCR， the mRNA expression differences of MC1R， Agouti and MITF genes in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat color （white，brown，black）  were detected . ［Result］ mRNA of MC1R， Agouti and MITF were expressed in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat color. The mRNA expression quantity of MC1R and MITF genes in the skin tissues of black Xinjiang goats were higher than those in brown and white goats （P>0.05）， the mRNA expression quantity of Agouti in the skin tissues of white Xinjiang goats was significantly higher than that in brown and black Xinjiang goats （P<0.05）. ［Conclusion］  MC1R， Agouti and MITF genes had some effects on the coat color formation of Xinjiang goats， which provided references for coat color breeding and variety improvement of Xinjiang goats in future.

Key words Xinjiang goats;MC1R gene;Agouti gene;MITF gene;Coat color

基金项目 自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目（ky2021）;国家绒毛用羊产业技术体系项目（CARS-39）；自治区肉毛兼用绒毛用羊品种选育提升计划岗位专家任务项目（2022XJRMY-04）。

作者简介 许艳丽（1986—），女，新疆乌鲁木齐人，高级实验师，从事羊遗传育种、毛绒加工研究。通信作者，研究员，硕士，从事毛绒加工与品质研究。

收稿日期 2022-03-15

新疆山羊是我国绒肉兼用型地方山羊品种，在新疆各地均有分布，其中心产区为东疆的哈密。新疆山羊绒毛品质优良且具有较好的产肉性能，在新疆畜禽种质资源中占有重要的地位。山羊绒是我国具有重要经济价值的毛绒资源之一，享有“软黄金”的美誉。毛色是绒山羊的一个重要生产性状，可作为重要的遗传标记，用于分子育种，是决定山羊绒经济价值的主要因素之一。新疆山羊被毛以白色为主，褐色和黑色次之。白色有利于毛纺业加工，更受消费者的青睐。哺乳动物毛色的形成受多个基因的作用，同时也受外界环境的影响。在黑色素形成的信号通路中黑色素皮质受体-1基因（MC1R）、酪氨酸酶基因（TYR）、刺鼠信号蛋白基因（Agouti）、肥大/干细胞生长因子受体基因（KIT）、小眼畸形相关转录因子（MITF）等对毛色形成发挥着重要的作用［1］。近年来，对动物毛色候选基因的研究很多，但有关新疆山羊毛色基因的研究较少。

笔者以新疆山羊MC1R、Agouti和MITF基因为研究对象，采用qRT-PCR分析其mRNA在不同毛色新疆山羊皮肤组织中的差异表达，分析3个毛色基因与新疆山羊毛色的关系，为深入研究MC1R、Agouti和MITF基因对毛色形成的作用提供理论依据，为通过毛色选择开展新疆山羊的选育扩繁奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品。

在新疆塔城地区和布克赛尔牧场选取不同毛色（白色、褐色、黑色）成年新疆山羊各3只，使用皮肤取样器进行皮肤样品采集，置于冻存管中液氮保存备用。

1.1.2 主要试剂及仪器。

1.1.2.1 主要试剂。

TRIzolTM Reagent（ambion）、5×All-In-One RT MasterMix（ambion）、EvaGreen Express 2×qPCR Master Mix-Low Rox（ambion）、M5 HiClear DL2000 DNA marker（聚合美）。

1.1.2.2 主要仪器。高速冷冻离心机（Thermo Fisher，美国）；Real Time PCR instrument（ABI，美国）；电泳槽（北京六一）；凝胶成像系统（上海天能）；微量分光光度计（杭州奥盛）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反转录。

将采集的皮肤组织液氮研磨，采用Trizol法提取不同毛色新疆山羊皮肤组织总RNA，使用微量分光光度计检测RNA浓度，再利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。按照5× All-In-One RT MasterMix反转录试剂盒步骤说明书进行反转录，-20 ℃下保存反转录产物。

1.2.2 主要仪器。引物设计与合成。

依据NCBI网站上已公布的MC1R、Agouti和MITF基因序列，利用 Primer Premier 5.0 软件进行定量引物设计，选用GAPDH基因作为内参基因，引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。以获得的cDNA为模板，参照 EvaGreen Express 2×qPCR Master Mix-Low Rox试剂盒说明书建立PCR反应体系（20.0 μL）：cDNA模板2.0 μL，扩增基因上下游引物各 0.6 μL，Evagreen 2×qPCR Master Mix 10.0 μL，RNase-free Water 6.8 μL。PCR反应程序：预变性95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 5 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，共40个循环。

1.2.4 数据统计与分析。

目的基因相对表达水平采用2-ΔΔCt方法计算，运用SPSS 19.0统计软件对各组目的基因mRNA相对表达量进行统计分析，采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 RNA提取

使用微量分光光度计检测样本总RNA浓度和纯度，测得A260/A280为1.8～2.0。RNA经过1%琼脂糖凝胶电泳检测发现条带整齐、完整、清晰，无严重拖尾（图1），可用于后续反转录。

2.2 不同毛色新疆山羊皮肤组织中MC1R、Agouti、MITF基因mRNA的表达分析 实时

荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明，MC1R、Agouti及MITF 基因mRNA 在不同毛色的新疆山羊皮肤组织中均有表达。MC1R基因 mRNA在黑色新疆山羊皮肤组织中表达量最高，见图2；Agouti基因mRNA在白色新疆山羊皮肤组织中的表达量显著高于褐色和黑色山羊（P<0.05），褐色和黑色山羊皮肤组织中Agouti基因mRNA表达量差异不显著（P>0.05）（图3）；MITF基因mRNA在黑色新疆山羊皮肤组织中的表达量高于其他毛色（P>0.05），见图4。

3 讨论

动物毛色主要由黑色素细胞产生的真黑素和褐黑素数量和分布决定，二者不同的含量和比例形成不同的毛色［2］。

MC1R基因是控制动物毛色的重要候选基因之一，在调控黑色素合成方面发挥着重要的作用，主要在毛囊和皮肤黑色素细胞中表达［2-3］，其表达影响黑色素细胞中真黑素的形成，大量MC1R基因表达会使动物呈黑色或褐色的毛色表型［4］。在绵羊［5-6］、羊驼［7］、牦牛［8］等动物皮肤组织中发现，MC1R基因mRNA在深色群体皮肤组织中的表达量均高于浅色群体。李洪涛等［9-10］研究发现MC1R基因是控制哈萨克羊被毛黑色的主效基因，哈萨克羊MC1R基因突变与黑色被毛呈极显著相关。大量研究表明，MC1R基因与动物的毛色性状表现相关。该研究结果表明，MC1R基因在黑色新疆山羊皮肤中的mRNA表达量最高，高于褐色和白色新疆山羊。这与景炅婕等［11］、蒋婧等［12］深色山羊群体皮肤组织中MC1R基因mRNA表达量高于浅色群体的研究结果相一致。

Agouti基因是调节哺乳动物毛色的基因之一，编码信号蛋白ASIP。该信号蛋白可以降低真黑素的合成，从而促进褐黑素的合成［13］。Agouti基因还可以通过抑制MITF的表达，降低酪氨酸酶活性，从而合成褐黑色素［14］。薛丽娜等［15-16］研究发现Agouti 基因外显子的单核苷酸突变多态性与绵羊被毛毛色不相关，说明Agouti基因可能不是控制绵羊被毛颜色的主效基因。杜楠［17］研究表明渝东白山羊各个组织中的ASIP基因表达水平极显著高于酉州乌羊（P<0.05）。该试验中白色新疆山羊Agouti 基因的mRNA表达水平最高，显著高于褐色和黑色新疆山羊（P<0.05），说明Agouti 基因在新疆山羊毛色形成过程中发挥作用，但是否为控制新疆山羊毛色的主效基因还有待深入研究。