理化因素对川泽泻凝集素血细胞凝集活性的影响

摘要 ［目的］明确温度、pH和金属离子等理化因素对川泽泻凝集素血细胞凝集生物学活性的影响。［方法］川泽泻块茎经研磨、浸取、硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析柱分离纯化得到凝集素（Alisma plantago-aquatica Linn.Lectin，APL），然后用系列温度、pH和金属离子等理化因素处理凝集素样品，应用倍比稀释法检测凝集素凝集人类血细胞活性。［结果］APL对家兔、家鸡、鲤鱼等动物血细胞无凝集作用，能使人ABO 4种类型血细胞发生不同程度凝集，对A型血细胞凝集活性明显高于其他3种血型红细胞。用20～100  ℃以10  ℃梯度处理后，川泽泻凝集素在20～40  ℃凝集活性很强，50  ℃凝集活性开始降低，在70  ℃仅具42%的凝集活性，80  ℃加热10 min完全失活；当pH为低于5.4或高于7.6时，凝集活性逐渐降低，当pH≤3.4或pH≥9.0时，川泽泻凝集素失去血细胞凝集活性；用EDTA透析后凝集素凝集活性基本消失，Ca2+、Mg2+、Mn2+、K+等离子能使凝集素凝集活性不同程度恢复。［结论］川泽泻凝集对热稳定性较弱；凝集活性最适pH为6.0～6.8，其凝集活性部分依赖于Ca2+、Mg2+等金属离子。

关键词 川泽泻凝集素；血细胞；理化因素；凝集活性

中图分类号 Q 513  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）02-0177-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.02.044

Effect of Physical and Chemical Factors on Hemagglutination Activity of the Lectin from Alisma plantago-aquatica

GUO Yan，CHEN Song-mei，ZHANG Zhong-wen et al

（Applied Biotechnology Innovation Research Center，Leshan Normal University，Leshan，Sichuan 614004）

Abstract ［Objective］To elucidate the effects of temperature，pH and metal ions on the biological agglutination activity of lectin from Alisma planago-aquatica.［Method］Tubers of Alisma planago-aquatica were grinded，leached，precipitated with ammonium sulfate，separated and the lectin （APL） was purified by ion exchange and affinity chromatography.Then the lectin samples were treated with a series of physical and chemical factors such as temperature，pH and metal ions，and the agglutination activity to human blood cells was detected by multiple dilution method.［Result］APL had no agglutination activity on red blood cells of rabbits，domestic chickens，carp and other animals.It could agglutinate four types of human ABO red cells in different degrees.The agglutination activity of APL to type a red blood cells was significantly higher than other red blood cells.The agglutination activity of Alisma planago-aquatica lectin was very strong at 20-40  ℃ and began to decrease at 50  ℃，only 42% at 70  ℃ and complete deactivation after heating at 80 ℃ for 10 min.When the pH was lower than 5.4 or higher than 7.6，the agglutination activity decreased gradually.When the pH was lower than 3.4 or higher than 9.0，the agglutination activity of Alisma planago-aquatica lectin lost.After dialysis with EDTA，the agglutination activity of lectin basically disappeared.The agglutination activity of lectin could be restored to some extent by different ions such as Ca2+，Mg2+，Mn2+，K+，and so on.［Conclusion］The agglutination activity of Alisma planago-aquatica lectin is weak to thermal stability，and the optimal pH is 6.0-6.8.The agglutination activity is partly dependent on Ca2+，Mg2+ and other metal ions.

Key words Alisma plantago-aquatica Linn.Lectin;Blood cell；Physicochemical factors；Hemagglutinating activity

基金项目 大学生创新创业计划国家级项目（202110649041）；大学生创新创业计划省级项目（S202010649129）；乐山师范学院大学生创新创业训练项目（2020XJ155）；乐山师范学院重点项目（LZD011）。

作者简介 郭艳（1999—），女，四川广元人，从事天然作物功能蛋白研究。通信作者，教授，硕士，硕士生导师，从事生物化学教学以及天然蛋白质分子结构与功能研究。

收稿日期 2022-03-16

川泽泻（Alisma plantago-aquatica Linn.）属泽泻科泽泻属水生地道中药，在福建、浙江、广西和四川有广泛分布，种植规模巨大，2018年产量约20 000 t，仅四川年产量最大，约11 000 t，广西次之［1］。川泽泻的药用处理常采用炮制方法，利用率低，经济效益差，导致近年来种植户积极性不高。四川泽泻和广西、福建泽泻品质有差异，有“川泽泻”“广泽泻”和“建泽泻”之称［2-3］。刘红昌等［4］和金立阳等［5］分别对四川泽泻进行了指纹图谱研究，为川泽泻和其他产区泽泻品质鉴定提供了依据。泽泻富含泽泻醇等有机物，具有利尿、抗结石、降血脂、降血糖和保肝等药效，张慧娟等［6］通过泽泻中有机化合物成分的分析，对泽泻的生理应用进行了详细总结。除小分子有机化合物外，泽泻药用块茎中富含蛋白质，刘超等［7］从四川种植基地川泽泻块茎中分离出一种能使人红细胞凝集的N-乙酰葡萄糖胺及其衍生物专一性结合含糖凝集素蛋白，分子质量为22.45 kD，等电点pI为6.0。同时利用荧光淬灭技术［7］对川泽泻凝集素生色基团的分布进行了初步研究，并用化学修饰的方法［8］对川泽泻凝集素的凝集活性中心氨基酸组成和生物学构象进行了研究。不同来源的凝集素结构稳定和生理功能行驶要求不同的环境因素，特别是凝集素所处微环境的物理与化学因素对凝集素结构和生理功能有明显的影响，但物理和化学因素对川泽泻凝集素凝集血细胞活性的影响鲜见报道。该研究探讨了温度、pH、金属离子等不同物理和化学因素对该生物学活性的影响，为揭示凝集素生物学构象及凝集活性与理化环境的关系提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 试验用川泽泻采自四川彭山谢家镇和乐山五通桥冠英镇。人血液采自乐山师范学院校医院。兔、鸡、鱼等动物血液采自乐山市中区海棠路农贸市场。所用化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 川泽泻凝集素样品的制备。参照文献［7］方法并稍作改动，川泽泻干燥块茎经研磨、硫酸铵沉淀、离子交换层析（DEAE-Sepharose）和甲壳素N-乙酰葡萄糖胺亲和层析得到凝集素样品，4 ℃保存备用。

1.2.2 血细胞悬液的制备。分别取人血（4种血型）和动物（家兔、家鸡、鲤鱼）血样10 mL，加少许枸橼酸钠，用0.9%生理盐水1∶1（v/v）混匀离心（2 500 r/min，4 ℃，15 min），重复至少3次洗去血浆其他成分，血细胞沉淀用0.9%生理盐水稀释至2%，滴1～2滴0.2%叠氮化钠，4 ℃保存备用。

1.2.3 凝集素凝集血细胞活力的测定。

参照文献［9］在96孔“V”型板上倍比稀释法检查凝集血细胞活性。

1.2.4 温度对川泽泻凝集素凝集血细胞活性的影响。

按10 ℃梯度在20～100 ℃，凝集素样品恒温10 min后用自来水流水或冰水冷却至室温，用A型血细胞悬液测定凝集血细胞活性［10］。

1.2.5 pH对川泽泻凝集素凝集血细胞活性的影响。

凝集素样品对pH为2.0、2.5、3.4、4.0、4.6、5.4、6.0、6.8、7.6、8.4、9.0的系列缓冲液充分透析2 h后用A型血细胞悬液检查凝集血细胞活性［9］。

1.2.6 金属离子对凝集素凝集血细胞活性的影响。

将凝集素样品溶液在0.05 mol/L的EDTA溶液中充分透析并放置过夜，以除去凝集素样品中金属离子，检测其对血细胞的凝集活性；然后均分为7份，其中一份置于0.9%生理盐水再次透析除去EDTA后，检测血细胞凝集活性；再次将其余6份分别滴加一滴0.01 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+，以未经EDTA处理的凝集素样品为对照，检测凝集A型血细胞活性［8］。

2 结果与分析

2.1 血细胞凝集活性 川泽泻凝集素对不同种类代表动物血细胞的凝集活性见表1。表1显示，川泽泻凝集素对不同类型血细胞的凝集活性存在差异，与刘超等［7］的研究结果一致。在供试血细胞中，川泽泻凝集素仅对人类血细胞具有敏感性，能够使人类血细胞凝集，其中对A型血细胞具有一定偏爱性，使A型血细胞凝集的效价为0.95 μg/mL，O型、AB型和B型血细胞凝集效价分别为15.30、15.30和31.50 μg/mL。而对哺乳类家兔以及家鸡血细胞无凝集能力，鱼类鲤鱼血细胞在与川泽泻凝集素接触时发生溶血性细胞破裂。凝集素能够使血细胞凝集是高度专一和复杂的与糖或衍生物识别过程，川泽泻凝集素能够识别人类血细胞而不识别哺乳动物家兔、家鸡和鱼类鲤鱼血细胞，是因为川泽泻凝集素是N-乙酰葡萄糖胺专一性结合凝集素［7-8］，表明川泽泻凝集素可识别一些乙酰化的糖链。由于人类血细胞表面具有N-乙酰葡萄糖胺糖和N-乙酰半乳糖基团［11］组成的糖被。凝集素和人类ABO血细胞表面的N-乙酰葡萄糖胺相互作用，通过凝集素分子桥的作用使血细胞凝集成团。凝集素表现出对A型血细胞的偏爱性，可能是A型血细胞与其他类型血细胞表面糖链的空间构象有差异［10］。