基于基因组微卫星的团头鲂养殖群体遗传多样性分析和指纹图谱构建
作者： 张芹 王延晖 王冰柯 屈长义 刘英杰
摘要 利用基因组微卫星检测2个团头鲂（Megalobrama amblycephala）养殖群体的遗传多样性，18个位点共检测到126个等位基因，大小在135～362 bp。各位点观测等位基因数（Na）在3～15个，平均为7个；有效等位基因数（Ne）在1.250～6.979，平均为3.603。各位点检测到的香农信息指数（I）在0.417～2.213，平均为1.384。观测杂合度（Ho）在0.219～0.856，平均值为0.647；期望杂合度（He）在0.200～0.857，平均值为0.665。多态信息含量指数（PIC）在0.190～0.843，平均值为0.624。群体间的遗传分化指数（Fst）为0.070，群体间的基因交流（Nm）为1.59，说明HH和YH 2个群体之间有一定程度基因流。2个位点检测到的近交系数（Fis）>0，其他16个位点近交系数均<0。研究表明，HH和YH两个人工养殖群体中均有较高的遗传多样性，群体间有一定程度的基因交流，指纹图谱的构建可以用来进行团头鲂种质资源品种间的鉴定以及品种内的亲缘关系研究，尤其是可以区分没有亲缘关系数据背景的群体，可以指导没有家系构建能力的苗种繁育场进行繁殖策略的升级。
关键词团头鲂；基因组；SSR；多态性
中图分类号S917文献标识码A
文章编号0517-6611（2023）08-0099-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.023开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Genetic Diversity Analysis and Fingerprint Construction for Two Cultured Populations of Megalobrama amblycephala on Genomic Microsatellites
ZHANG Qin，WANG Yan-hui，WANG Bing-ke et al（Henan Academy of Fishery Sciences，Zhengzhou，Henan 450044）
AbstractIn this study，the genetic diversity for two populations of Megalobrama amblycephala was detected using genomic SSR.The results showed that 126 alleles were detected in 18 microsatellite loci，ranging from 135 bp to 362 bp.The observed heterozygosity ranged from 3 to 15，with mean value of 7.The expected heterozygosity ranged from 1.250 to 6.979，with mean value of 3.603.The Shannon information index was between 0.417 and 2.213，with an average of 1.384.The observed heterozygosity was between 0.219 and 0.856，with an average of 0.647.The expected heterozygosity was between 0.200 and 0.857，with an average value of 0.665.The polymorphism information content ranged from 0.190 to 0.843，with mean value of 0.624.The genetic differentiation index between the populations was 0.07，and the gene flow was 1.59，indicating that there was a certain degree of gene flow between the two populations.The inbreeding coefficients at two loci were greater than zero，and at the other 16 loci were all less than zero.In summary，the genetic diversity among the two pupulaitons was mid-high，and there was a certain degree of gene exchange between the two populations，which showed that all the artificial selection breeding strategies for the two cultural populations could maintain population diversity.There was a large genetic difference between wild individuals and cultured populations，which could be used as an effective supplement for the genetic diversity of Megalobrama amblycephala in later breeding process.Using these tags，the fingerprint was constructed for two Megalobrama amblycephala group.These microsatellite loci can be used for identification and genetic relationship research of megalobrama amblycephala germplasm resources.Especially，these tags can be used to distinguish pupulations with no pedigree data background and then to guide strategies for breeding ground without family building capacity.
Key wordsMegalobrama amblycephala;Genome;SSR;Polymorphism
团头鲂（Megalobrama amblycephala）为我国特有的淡水经济鱼类，因其生长快、成活率高、易捕捞、肉质好等优点，在全国各地均有养殖。团头鲂“华海1号”水产新品种经第五届全国水产原种和良种审定委员会审定通过，具有遗传性状稳定、生长快、成活率高等优良特征［1］。“伊河鲂”在分类上属于鲂属团头鲂，是近年来开发黄河流域土著鱼类品种时，选育出来的一个优良新品系［2］。微卫星标记（microsatellite）由于重复性好，多态性高，广泛应用于水生动物的种质资源鉴定以及遗传多样性研究［3-4］，尤其是利用SSR的多态性对水生生物进行亲子鉴定的较多［5-7］。李宝玉等［8］利用微卫星标记对团头鲂二倍体和三倍体群体进行遗传特性分析，Xiong等［9］利用微卫星技术对团头鲂群体不同家系的肌间刺数量进行研究，而有关团头鲂基因组微卫星研究鲜见报道。笔者对团头鲂基因组SSR序列进行分析，筛选得到若干多态性微卫星SSR标记，笔者利用这些标记，对2个团头鲂养殖群体进行遗传多样性研究和指纹图谱的构建，旨在为团头鲂种质资源品种间的鉴定以及品种内的亲缘关系研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料在河南省嵩县陆浑水库伊河鲂鱼种厂采集团头鲂伊河群体100尾，以下简称YH群体；从湖北省鄂州国家级团头鲂原种场采集团头鲂“华海1号”群体100尾，以下简称HH群体；在湖北省鄂州市梁子湖采集野生团头鲂个体2尾，以下简称LZH个体。所有个体测量体长、体重，剪尾鳍用无水乙醇保存备用。
1.2方法
1.2.1团头鲂DNA的提取。团头鲂DNA用磁珠法基因组DNA提取试剂盒（天根生化）提取，经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，用超微量分光光度计（NanoDrop One spectrophotometer）检测 DNA 浓度和纯度，置于 -20 ℃低温保存。
1.2.2PCR扩增及SSR检测。挑选出18对微卫星引物［10］，使用 M13 通用接头序列（TGTAAAACGACGGCC AGT）加到每对引物的 F 引物的 5′方向，并合成带不同荧光基团的 M13 接头序列。
PCR 反应体系（15 μL）：2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，Mix primer 2.0 μL，基因组DNA模板 1.0 μL（50～200ng），dd H2O 4.5 μL。PCR扩增条件：96 ℃ 预变性 3 min（96 ℃ 变性 30 s，59～60 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min）共 30个循环，72 ℃ 终延伸 10 min，12 ℃保存。
1.2.3荧光毛细管电泳检测。取3 μL荧光PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测PCR条带是否单一、片段大小是否与预期一致。条带单一且大小相符的，对照DNA Marker的浓度进行定量，将所有产物稀释至相同的浓度范围，取1 μL PCR稀释产物加10 μL甲酰胺（含0.5μL内标）变性后上DNA测序仪ABI 3730xl进行毛细管荧光电泳检测。
1.2.4结果整理。将毛细管电泳检测结果导入GeneMarkerV2.2.0 分析软件中对原始数据进行条带分型，每对引物导出PDF峰图文件，结果汇总统计后进行分析。
各位点等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）等遗传多样性参数使用GenAIex软件计算，各位点的多态信息含量指数（PIC）由Cervus软件计算，群体Hardy-Weinberg 平衡偏离用固定指数F衡量，使用GenAIex软件进行群体的哈代温伯格平衡检验。群体间的聚类分析运用 Phylip 软件对其进行 UPGMA方法构建系统发生树。群体间遗传分化系数（Fst）、地方群体内近交系数（Fis）、基因差异分化系数（Gst）、分子方差、PCA分析由GenAIex软件进行运算，热点图为R语言绘制。连锁不平衡使用R包poppr的pair.ia方法进行分析，图用R语言绘制。
2结果与分析
2.1各位点遗传多样性参数由表1可知，采用的基因组微卫星位点均为多态性位点，18个位点共检测到126个等位基因，大小在135～362 bp。各位点观测等位基因数目（Na）在3～15个，平均数为7个；有效等位基因数（Ne）在1.250～6.979，平均值为3.603。各位点检测到的香农信息指数（I）在0.417～2.213，平均值为1.384。观测杂合度（Ho）在0.219～0.856，平均值为0.647；期望杂合度（He）在0.200～0.857，平均值为0.665。多态信息含量指数（PIC）在0.190～0.843，平均值为0.624。各位点检测到的遗传分化指数（Fst）值0.010～0.174，平均值为0.070。在ZQTTF079和ZQTTF257两个位点检测到的近交系数（Fis）>0，其他位点近交系数均<0。基因流（Nm）为1.185～25.302，平均值为6.047。HH群体在ZQTTF079、ZQTTF124、ZQTTF149、ZQTTF157、ZQTTF209和ZQTTF262位点上显著偏离哈代温伯格平衡，YH群体在ZQTTF023、ZQTTF050、ZQTTF079、ZQTTF112、ZQTTF124、ZQTTF149、ZQTTF209、ZQTTF252位点上显著偏离哈代温伯格平衡，其中ZQTTF079、ZQTTF124、ZQTTF149、ZQTTF209 位点在2个群体中都显著偏离哈代温伯格平衡。