草地贪夜蛾体表靶向TRPV1的毒素分子筛选及其功能研究

摘要［目的］探究草地贪夜蛾诱发人畜危害的分子机制，以草地贪夜蛾诱发人畜呼吸道炎症、疼痛等危害的潜在生理靶点（瞬时电位感受器香草酸受体1，TRPV1）为切入点，揭示草地贪夜蛾体表物质诱发人畜危害的毒素物质基础和生理靶点。［方法］通过凝胶分子筛以及高效液相色谱等方法对草地贪夜蛾体表物质进行分离和纯化，结合膜片钳电生理技术筛选草地贪夜蛾体表物质中靶向TRPV1的活性毒素组分。［结果］从草地贪夜蛾体表物质中分离纯化到一种能够高效（100 mg/L）激活TRPV1的毒素组分V-7，该组分能特异性作用于TRPV1，而对常见离子通道类膜蛋白生理受体（如钠离子通道NaV1.4、NaV1.5、NaV1.7，以及钾离子通道KV1.1、KV2.1、KV4.1）没有作用。［结论］从草地贪夜蛾体表混合物中可分离得到一种高效且特异性激活动物生理靶点TRPV1的毒素组分，部分揭示了外来入侵农业害虫草地贪夜蛾诱发人畜危害的物质基础及生理靶点。

关键词草地贪夜蛾；体表物质；TRPV1；毒素

中图分类号S433.4文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）11-0065-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.015开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Molecular Screening and Functional Investigation of Toxins Targeted to TRPV1 in the Body Surface of Spodoptera frugiperda

LIU Jia-yi，ZHANG Hao-yuan，FENG Wen-ling et al（College of Wildlife and Nature Reserves， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract［Objective］In order to explore the molecular mechanism of human-animal hazards induced by the fall armyworm， the potential physiological targets （transient receptor potential vanillic acid subtype 1， TRPV1） inducing human and animal respiratory inflammation and pain were used as the entry point， and the toxin material basis and physiological targets of the body surface substance of Spodoptera frugiperda were used as the entry point to reveal the toxin substance basis and physiological target of the human and animal hazards induced by the material on the surface of Spodoptera frugiperda. ［Method］The body surface substance of the grass moth was isolated and purified by gel molecular sieve and high performance liquid chromatography， and the active toxin components targeting TRPV1 in the body surface sunstance of the grass night moth were screened by combining patch clamp electrophysiology technology. ［Result］A toxin component V-7 that can efficiently （100 mg/L） activate TRPV1 was isolated and purified from the body surface substance of the grassland nightcrawler， which can act specifically on TRPV1， but has no effect on common ion channel membrane protein physiological receptors （such as sodium channel Nav1.4， Nav1.5， Nav1.7， and potassium channel Kv1.1， Kv2.1， Kv4.1）. ［Conclusion］It is shown that a toxin component that efficiently and specifically activates the animal physiological target TRPV1 can be isolated from the body surface substance of Spodoptera frugiperda， which partially reveals the material basis and physiological target of the human and animal hazards induced by the invasive invasion of Spodoptera frugiperda in agriculture and forestry.

Key wordsSpodoptera frugiperda;Body surface substance;TRPV1;Toxin

鳞翅目害虫在农业生产中危害严重，对于生态系统、人类生产以及健康等方面都会造成影响，而外来入侵物种由于更强的竞争能力和缺乏天敌等原因会加剧上述危害的程度［1］。草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是一种对农业危害严重的外来入侵物种，是联合国粮农组织向全球发出预警的重大迁飞性害虫，具有杂食暴食性、迁飞速度快、繁衍能力强、辨别困难等特点［2］，严重影响我国作物产量，破坏当地生态系统结构与功能，影响农业发展，威胁国家农业生产与粮食安全与人畜健康［3］。截至2019年8月17日，草地贪夜蛾在我国24个省份1 366个县（市、区）分布，随着其分布范围不断扩大，在危害玉米等作物的同时，其与人畜接触的概率也大大增加［4-7］。研究表明，草地贪夜蛾的接触会导致人畜产生呼吸道炎症、疼痛等不良反应［8］，但草地贪夜蛾通过何种毒素物质作用于人类尚鲜见报道，相应的生理靶点尚未被揭示，同时毒素物质与相应生理靶点的互作分子机制仍未被探明［9-11］。由此，探明农业害虫草地贪夜蛾导致人畜危害的毒素物质基础和生理靶点，可以阐明草地贪夜蛾导致人畜危害的分子机制，也可以为草地贪夜蛾诱发人畜危害的科学防治提供理论基础。

瞬时电位感受器香草酸受体1（transient receptor potential vanillic acid subtype 1，TRPV1），又称辣椒素受体，是一种非选择性阳离子通道，广泛分布于哺乳动物的皮肤、呼吸道等器官的神经末梢中，与环境温度感知、疼痛信号传递、炎症和免疫激活、咳嗽引发等生理活动相关［12-15］。其特异性激活剂香草酸类似物等刺激性物质可引起动物产生疼痛、咳嗽、神经源性炎症等症状，这些不良反应与接触飞蛾引起的呼吸道炎症、疼痛等症状类似［16-18］。同时，有研究表明，动物接触草地贪夜蛾的主要成分为其体表的物质（如鳞粉等）［8］。因此，笔者推测草地贪夜蛾体表物质中可能含有可以激活TRPV1的毒素物质成分。这些物质中的相应毒素物质通过特异性靶向TRPV1，导致人畜接触草地贪夜蛾后产生呼吸道炎症等症状。笔者利用蛋白纯化、高效液相色谱等技术对草地贪夜蛾体表物质进行了分离和纯化，并利用膜片钳电生理以及微量药物灌流等技术进行了功能筛选研究。通过这些研究，从草地贪夜蛾体表物质混合物中分离得到一种高效且特异性激活动物生理靶点TRPV1的毒素物质，揭示了草地贪夜蛾诱发人畜危害的部分物质基础及生理靶点。

1材料与方法

1.1材料与仪器将购买的草地贪夜蛾蛹放置室内饲养7 d［T=（25±1） ℃，L∶D=12∶12 h，RH=（75±5）%］，待其羽化后，采集成虫翅膀与体表物质，液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱中。

试验试剂：PBS（18 g/L NaCl、0.20 g/L KCl、1.44 g/L Na₂HPO₄、0.24 g/L KH₂PO₄，HCl调至pH=6），Sephadex G-50凝胶（Amersham Biosciences）、乙腈（Thermo）、DMEM细胞培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、Lipofectamine 2000、OptiMEM培养基、电生理试验所使用的试剂均购于Thermo公司，质粒小提中量试剂盒购于生工生物工程（上海）有限公司，KOH、HEPES、氯化胆碱、D-glucose、MgCl₂、CaCl₂、KOH均购于Sigma公司，所有试验用水均为超纯水。

试验仪器：生物安全柜（ESCO，日本）；-80 ℃超低温冰箱（Panasonic，日本）；高效液相色谱仪（Waters 1525，美国）；蛋白纯化系统（AKTA pure，中国）；电子天平（Sartorins TE124S）；台式离心机（Eppendorf Centrifuge 5424）；冷冻台式离心机（Sigma 3-18K、Scan Spend 1730R）；紫外分光光度计（UNICO）；电子脉冲刺激仪（LGT-2300S）；质谱仪（MALDI-TOF，Bio）；C18柱（30.0 mm×4.6 mm，Aglient）；凝胶过滤层析玻璃柱（北京瑞达恒辉公司）；冷冻干燥机（Thermo）；移液器（Eppendorf）；超纯水仪（Synergy，爱尔兰）；高压蒸汽灭菌锅（Zealway）；pH计（Thermo）；电子分析天平（Sartovius）；膜片钳系统（HEKA）；电机控制仪（PC-50，Narishige）；灌流装置（Biorep Perfusion Apparatus）。

试验所用人胚肾细胞（HEK293T）由实验室保存并传代培养；试验用质粒由实验室提供并保存。

1.2葡聚糖凝胶Sephadex G-50分离

1.2.1凝胶装填。55 g Sephadex G-50用1.1 L的PBS溶液混匀，100 ℃水浴1～2 h后，置于真空抽制器中3～4 h；缓慢向凝胶柱中一次性加入凝胶后，设置蛋白纯化仪流速0.3 mL/min，待凝胶稳定在指定位置后，卸下装柱器，设置PBS溶液流速为0.3 mL/min，过夜灌流。

1.2.2样品预处理。取适量样品于5 mL 4 ℃冰箱预冷的PBS溶液中溶解，离心（12 000 r/min，4 ℃，10 min），吸取上清液，0.22 μm针孔式微孔滤膜过滤，置于冰上备用。

1.2.3上样。用5 mL注射器吸取样品，通过蛋白纯化仪上样口，每次缓慢推入1 mL样品。

1.2.4洗脱与收集。设置流速为1 mL/min，样品洗脱液收集在干净玻璃管中，洗脱产物按波长215 nm和280 nm光吸收值峰值位置的不同将洗脱液合并，冷冻干燥机冻干备用。