白术叶片DNA提取方法的优化

摘要［目的］优化白术叶片DNA提取方法，提取高质量DNA，用于分子生物学研究。［方法］以白术叶片为材料，比较常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法、试剂盒法提取DNA的效果，并对改良CTAB法中的裂解温度、裂解时间、核分离液解离次数进行优化，用琼脂糖凝胶电泳和微量核酸测定仪检测DNA的浓度和纯度。最后通过ISSR-PCR验证优化的改良CTAB法提取DNA的效果。［结果］4种方法中，改良CTAB法提取白术叶片DNA效果最好。针对叶片的改良CTAB法的优化条件为裂解温度65 ℃、裂解时间20 min、解离次数2 次；ISSR-PCR验证结果表明扩增条带清晰稳定，无拖尾。［结论］优化后的改良CTAB法提取白术叶片DNA质量高，可用于白术种质资源遗传多样性分析。

关键词白术；DNA；提取方法；改良CTAB法

中图分类号R284文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）11-0128-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.032开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of DNA Extraction Method for Atractylodes macrocephala Leaves

JIANG Xiao-gang，WANG Hua，ZHOU Wu-xian et al（Key Laboratory of Biology and Cultivation of Herb Medicine，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Chinese Herbal Medicines，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Enshi，Hubei 445000）

Abstract［Objective］To optimize the DNA extraction method of Atractylodes macrocephala leaves and extract high-quality DNA for molecular biology research.［Method］A.macrocephala leaves were used as material，the DNA extraction effects of four methods （conventional CTAB，modified CTAB，SDS and Kit method） were compared，and the cracking temperature，cracking time and times of nuclear separation liquid extraction in the modified CTAB method were optimized，the concentration and purity of the extracted DNA were detected by agarose gel electrophoresis and spectrophotometer.Finally，the effects of DNA extracted by the modified CTAB method after optimization was verified by ISSR analysis.［Result］Among the four extraction methods，the modified CTAB method had the best extraction effects of DNA.The optimal extraction conditions of the improved CTAB method of leaves were as follows：cracking temperature was 65 ℃，cracking time was twenty minutes，dissociation times was twice.The ISSR-PCR validation results showed that the amplified bands were clear and stable，without any trailing.［Conclusion］The optimized CTAB method was effective in extracting DNA of A.macrocephala leaves.And it could be used for genetic diversity analysis of A.macrocephala.

Key wordsAtractylodes macrocephala;DNA;Extraction method;Modified CTAB method

白术 （Atractylodes macrocephala Koidz.） 属于菊科苍术属多年生草本植物，以根茎入药，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎的功效［1］。基于分子生物学技术开展药用植物种质资源评价工作尤为重要，而高效提取DNA是更好进行分子生物学研究的前提，此外，大多数药用植物组织中富含多糖、多酚等物质，常规方法提取的DNA较难满足PCR、基因克隆、测序等分子生物学需求，因此很多学者开展了药用植物基因组DNA提取方法的优化研究，以建立高效提取高质量DNA的方法。

邵亚林等［2］以杏黄兜兰叶片为材料，比较了CTAB法、改良CTAB法、高盐低pH法和 SDS法提取DNA的效果，结果表明，改良CTAB法优于其他方法，但提取的DNA存在一定蛋白质污染，且未进行PCR扩增反应验证。郑斯斯等［3］以壳斗科植物叶片为材料，比较不同方法提取DNA效果并对最佳方法进行优化，结果表明，优化后的改良CTAB法提取DNA浓度和纯度高，适用于PCR扩增和酶切反应。针对不同药用植物或药用植物的不同组织，需建立相适应的DNA提取方法，而有关白术不同组织基因组DNA提取方法的研究较少，多采用CTAB法。如黄恒等［4］对改良CTAB法和SDS法提取白术叶片基因组DNA的效果进行比较，结果表明，改良CTAB法提取白术叶片DNA质量高于SDS法，可作为模板用于分子标记研究，但提取DNA用时较长；王志安等［5］采用CTAB法提取白术幼嫩叶片的基因组DNA，并构建了DNA指纹图谱，结果表明，提取的白术基因组DNA适用于AFLP指纹图谱分析，但存在一定量蛋白质、多酚等物质污染；曹亮等［6］采用改良CTAB法提取白术、苍术的干种子DNA，并通过多重PCR技术对白术、苍术混杂种子进行鉴别，结果表明，提取的DNA模板满足于多重PCR反应，但提取DNA所需时间较长。也有研究采用试剂盒法提取白术DNA，如余亚东等［7］采用试剂盒法提取白术、苍术根茎DNA，并建立了鉴别白术、苍术等的DNA条形码技术，结果表明，提取的DNA模板适用于PCR扩增及进一步的种质鉴定研究，但DNA提取量较低，且成本高。以上研究，以白术为研究对象，主要采用改良CTAB法提取基因组DNA，基本能满足分子生物学的研究，但存在用时较长、DNA质量偏低的问题，虽然试剂盒法能有效去除DNA中的多糖多酚物质，但成本较高、提取DNA量较少，同时伴随一定降解［3］。该研究以白术幼嫩叶片为材料，比较常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法、试剂盒法提取DNA的效果，并对改良CTAB法中的裂解温度、裂解时间、解离次数等因素进行优化，然后用琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸检测仪检测DNA浓度和纯度，最后通过ISSR-PCR验证优化的改良CTAB法提取DNA的效果，以便用于白术遗传多样性分析、种质鉴定等研究。

1材料与方法

1.1试验材料供试材料包括一年生白术幼嫩叶片。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）、核糖核酸A（RNaseA）、氯仿、异戊醇、异丙醇、DL2000 DNA Marker、琼脂糖，均购自武汉中恩科技有限公司。主要仪器设备包括离心机（SIGMA 3K15）、电泳仪（DYCP-31DN）、超微量核酸蛋白测定仪（Thermo NANODROP ONE）、PCR仪（DYY-12）。

1.2试验方法

1.2.1不同DNA提取方法。采用常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法和试剂盒法提取白术叶片基因组DNA。

1.2.1.1常规CTAB法。参照马辉等［8］的方法并进行改进，具体步骤如下：取0.2 g白术幼嫩叶片于预冷研钵中，液氮中迅速研磨后转入2 mL离心管中，加入800 μL CTAB核裂解液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;50 mmol/L EDTA，pH 8.0;1.4 mol/L NaCl;2％CTAB;2％PVP;2％β-巯基乙醇）和20 mg/mL蛋白酶K 5 μL，65 ℃水浴40 min（期间每隔10 min轻轻摇动离心管一次），然后加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），混匀30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清液至2 mL离心管中，然后加入等体积的预冷异丙醇，混匀，12 000 r/min离心15 min，弃上清。用95％乙醇清洗沉淀2次，室温风干，加50 μL TE缓冲液溶解沉淀，加5 μL RNaseA （10 mg/mL）混匀，室温放置30 min，-20 ℃保存备用。

1.2.1.2改良CTAB法。取0.2 g白术幼嫩叶片于预冷研钵中，液氮中迅速研磨后转入2 mL离心管中，加入1.5 mL 4 ℃预冷的核分离液混匀，12 000 r/min离心10 min，弃上清收集沉淀，将上述收集沉淀按常规CTAB法提取。

1.2.1.3SDS法。参照王景雪等［9］的方法稍作改动，具体步骤如下：①取0.2 g白术幼嫩叶片于预冷研钵中，液氮中迅速研磨后转入2 mL离心管中，加入800 μL溶液I （500 mmol/L NaCl;50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;50 mmol/L EDTA;2％PVP;2％β-巯基乙醇），置于室温数分钟至解冻；②加入280 μL 10％SDS，轻轻混匀，45～65 ℃水浴20～40 min（期间每隔10 min轻轻摇动离心管一次）；③取出后立即置于冰上，并加入120 μL 5 mol/L 醋酸钾于冰上反应30 min，在12 000 r/min、4 ℃下离心20 min；④取上清液，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后，-20 ℃放置1 h，于4 ℃下离心20 min；⑤弃上清液，用500 μL TE缓冲液溶解沉淀，向其中加入2/3体积的氯仿-异戊醇（24∶1）混匀后，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；⑥取上清液，向其中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3 mol/L NaCl，于-20 ℃放置1 h，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min；⑦弃上清，用95％乙醇洗涤沉淀1次，室温风干；⑧加50 μL TE缓冲液溶解沉淀，加5 μL RNaseA （10 mg/mL）混匀，室温放置30 min，然后置于-20 ℃保存备用。

1.2.1.4试剂盒法。采用天根生化科技（北京）有限公司生产的新型植物基因组提取试剂盒（DP320-02）。具体步骤如下：①取植物新鲜组织100 mg或干重组织20 mg加入液氮充分碾磨；②加入400 μL缓冲液LP1和6 μL RNaseA（10 mg/mL）旋涡振荡1 min，室温放置10 min；③加入130 μL缓冲液LP2，充分混匀旋涡振荡1 min，然后12 000 r/min离心5 min，将上清移至新的离心管中；④加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀；⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，然后12 000 r/min离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑥向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），然后12 000 r/min离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑦重复操作步骤⑥；⑧12 000 r/min离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CB3室温放置2 min彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；⑨将吸附柱CB3转入新的1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50～200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。

1.2.2改良CTAB法提取白术叶片DNA的优化试验。

1.2.2.1裂解温度优化。采用改良CTAB法提取白术叶片DNA，裂解温度设为45、55、65 ℃，其他条件不变，详见“1.2.1.2”。

1.2.2.2裂解时间优化。采用改良CTAB法提取白术叶片DNA，裂解时间设为20、30、40 min，其他条件不变，详见“1.2.1.2”。

1.2.2.3核分离液解离次数优化。采用改良CTAB法提取白术叶片DNA，解离次数设为0、1、2次，其他条件不变，详见“1.2.1.2”。

1.2.3DNA提取浓度和纯度检测。

1.2.3.1超微量核酸蛋白测定仪检测。取2 μL DNA提取液，用超微量核酸测定仪检测DNA浓度（ng/μL）和纯度。DNA提取量（mg/g）＝DNA浓度×50×10-6/组织鲜重或干重；DNA质量判定标准：当OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.80时，纯DNA；当OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.80～2.00时，属于正常范围；当OD₂₆₀/OD₂₈₀＞2.00时，说明有大量RNA污染；当OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.80时，说明有蛋白质、酚类等污染。