基于QuEChERS-超临界流体色谱-串联质谱法的茶叶中甲胺磷及乙酰甲胺磷对映体拆分及定量

摘要采用QuEChERS法提取，在以Chiral-Pak IC-3为色谱柱的超临界流体色谱上拆分，大气压化学电离后串联四极杆质谱法测定。结果表明，茶叶中（+）-甲胺磷、（+）-乙酰甲胺磷的检出限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg，平均回收率为70.53%～110.61%，相对标准偏差（RSD）为2.92%～13.30%。该方法能够有效拆分和定量甲胺磷和乙酰甲胺磷对映异构体。

关键词QuEChERS；超临界流体色谱-串联质谱；茶叶；甲胺磷；乙酰甲胺磷；对映异构体

中图分类号TS272文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）11-0156-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.038开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Separation and Quantification of Methamidophos and Acephate Enantiomer in Tea Based on QuEChERS-Supercritical Fluid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Li（Beijing Institute of Food Inspection and Research （Beijing Food Safety Monitoring and Risk Assessment Center），Beijing 100094）

AbstractExtraction was performed by QuEChERS method，separated on supercritical fluid chromatography using Chiral Pak IC-3 as the chromatographic column，and determined by atmospheric pressure chemical ionization followed by tandem quadrupole mass spectrometry.The result showed that the detection limit of （+）-methamidophos and （+）-acephate in tea was 5 μg/kg，the limit of quantification was 10 μg/kg.The average recoveries were 70.53%-110.61% and RSD were 2.92%-13.30%.This method can effectively separate and quantify methamidophos and acephate enantiomer.

Key wordsQuEChERS;Supercritical fluids chromatography-tandem mass spectrometry;Tea;Methamidophos;Acephate;Enantiomer

手性是指物质本身立体空间结构左右对称呈镜像，如同人的左右手，相似却不能重叠，是自然界本质属性之一［1］。受生产技术、成本及实际使用等条件的约束，目前世界上有近25%的商用农药具有对映异构体［1］，而在我国这一比例估计超过40%［2］。在农药中手性对映异构体常表现出不同的生物活性，一种对映体具有高靶标活性的同时，另一种可能是低效或无效的。另一方面多数手性农药其中一个对映体比其外消旋体显示出更强的急性毒性，且与其余对映体的急性毒性存在显著差异［3］。如腈菌唑的（+）-对映体的抗菌活性是（-）-对映体的1.79～1.96倍，同时其毒性也更大［4］；多效唑的杀菌活性（2R，3R）-（+）-对映体高于（2S，3S）-（-）-对映体，但对植物生长调节活性则恰好相反；不同锐劲特的对映体在网纹水蚤体内所表现出的急性毒性［5］和生殖毒性［6］也不同。目前，为保护环境和人体健康，很多国家和地区立法限定外消旋农药的使用，要求必须使用具有正向活性的单一异构体，减少低活性异构体的使用［7-8］。

甲胺磷和乙酰甲胺磷是高效的有机磷杀虫剂，其分子结构中均包含1个磷原子手性中心，分别有2个对映异构体。根据Bertolazzi等［9］的研究，（+）-甲胺磷具有潜在的神经毒性，而（-）-甲胺磷则无法引起神经损伤。乙酰甲胺磷、甲胺磷的（+）-对映体对家蝇的毒性较（-）-对映体更大［10］。（+）-甲胺磷对大型蚤的毒性是（-）-甲胺磷的7倍，而在体外牛细胞试验中，（-）-甲胺磷对乙酰胆碱酯酶的抑制作用比（+）-甲胺磷强8.0～12.4倍［11］。由于甲胺磷毒性强烈，2008年我国就停止对其生产使用，而乙酰甲胺磷虽可使用，但在植物体内会转化成甲胺磷［12］。在我国现行有效的食品中农药残留限量标准中，甲胺磷、乙酰甲胺磷在茶叶中的最大残留限量均为50 μg/kg，但标准仅针对外消旋体含量制定，因此，研究毒性不同的对映体的识别和定量分析技术，有利于更科学地评估其使用过程中的安全性。

近年来，手性农药的拆分及定量分析技术逐渐发展，伴随手性固定相的不断开发，包括液相色谱［13-15］、气相色谱［16-17］、毛细管电泳［18］等分离技术被运用在手性化合物拆分工作中，有报道使用手性液相色谱［19］和气质联用法［20］对甲胺磷或乙酰甲胺磷进行了对映体拆分。超临界流体色谱作为一种新型的分离方法，在手性化合物拆分上有独特的优势［21-22］，目前，已在包括有机磷类［23］、拟除虫菊酯类［24］、砜亚胺类［25-26］、三唑类［27-28］、苯氧羧酸类［29］等手性农药的对映体拆分中得到了应用，但鲜见采用超临界流体色谱对甲胺磷或乙酰甲胺磷进行对映体拆分的相关报道。该研究建立了基于QuEChERS前处理技术、超临界流体色谱（SFC）分离、串联质谱法检测的茶叶中甲胺磷、乙酰甲胺磷对映体拆分及定量检测的技术方法，以期为对映体活性研究奠定工作基础。

1材料与方法

1.1试剂药品甲胺磷外消旋体（CAS10265-92-6，纯度99%），购自德国Dr.Erenstofer公司；乙酰甲胺磷外消旋体（CAS30560-19-1，纯度98%），购自美国USP公司；甲醇、异丙醇、乙腈、乙醇和甲酸均为色谱纯，购自美国thermo Fisher公司；二氧化碳（纯度99.99%）、高纯氮（纯度≥99.999%）、高纯氩（纯度≥99.999%），购自北京亚南气体公司；QuEChERS试剂包，购于美国安捷伦科技；试验用水来自Milli-Q纯化水系统，电阻率18.2 MΩ·cm。

1.2仪器设备岛津超临界色谱-串联质谱仪（Nexera UC），配有LC-30ADSF二氧化碳输送泵、LC-20ADXR四元溶剂输送泵、SFC-30A背压调节单元、SIL-30AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱、CBM-20A系统控制器，购自日本岛津公司。LCMS-8050三重四极杆质谱仪，配有大气压化学电离源，使用高纯氮气作雾化气和干燥气，高纯氩气为碰撞气，购自日本岛津公司。操作软件为岛津Labsolution v.5.82 SP1。Thermo X1R高速冷冻离心机，购自美国赛默飞世尔科技。水平振荡器，购自德国IKA公司。旋转蒸发仪，购自日本东京理化株式会社。

1.3色谱条件色谱柱为Daicel Chiral-pak IC-3 SFC柱（3.0 mm×150 mm，3 μm）；流动相A为超临界二氧化碳，B为异丙醇；梯度洗脱：0～4.0 min 10%～42%B，4.0～6.0 min 42% B，6.0～6.5 min 42%～10% B，6.5～10.0 min 10% B；流速2 mL/min，柱温20 ℃；背压10 MPa，进样体积1 μL，自动进样器温度10 ℃，洗针溶液为乙腈。

1.4质谱条件甲胺磷对映体的质谱参数为母离子142.0（m/z）， Q1预四级杆电压-12 V，子离子94.2/125.2（m/z），Q3预四级杆电压-15 /-20 V，碰撞能量-15/-18 eV；乙酰甲胺磷对映体的质谱参数为母离子183.7（m/z）， Q1预四级杆电压-14 V，子离子143.2/125.2（m/z），Q3预四级杆电压-25/-20 V，碰撞能量-11/-18 eV；添加剂为1% （V∶V）甲酸甲醇溶液，以流速0.2 mL/min在进入质谱前与色谱馏出液混合。采用大气压化学电离源，正离子模式，多反应监测模式采集。离子驻留时间50 ms，雾化气流速3 L/min，干燥气流速5 L/min，碰撞气压力270 kPa，离子传输管温度150 ℃，加热模块温度200 ℃，接口温度300 ℃。

1.5标准溶液的配制准确称取甲胺磷、乙酰甲胺磷外消旋体各10.0 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到浓度为10 mg/mL的外消旋体溶液。由于外消旋体为摩尔比1∶1的对映体混合物，因此在溶液中（+）-甲胺磷、（-）-甲胺磷、（+）-乙酰甲胺磷和（-）-乙酰甲胺磷的浓度均为5 mg/mL。使用前根据需要用异丙醇稀释。

1.6样品前处理茶叶样品均购自本地市场，并保存于干燥通风的室温环境中。样品经粉碎后，称取2.0 g，置于50 mL旋盖离心管中，加入20 mL水充分浸润2 h以上，加入20 mL乙腈、4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g 柠檬酸钠和0.5 g 倍半水合柠檬酸氢二钠，剧烈振摇1 min，在水平振荡器上以300 r/min 的转速振摇15 min以混合均匀。8 000 r/min离心10 min，取12 mL上层清液，置于含1 200 mg MgSO4、400 mg C₁₈、400 mg N-丙基乙二胺（PSA）、45 mg石墨化炭黑（GCB）的净化管中，涡旋振荡5 min，取10 mL上清液，于40 ℃下旋蒸至近干，加入1.0 mL异丙醇溶解残渣，过0.22 μm滤膜，上机测定。

2结果与分析

2.1对映体拆分条件的优化保留因子（k1、k2）、分离因子（α）及分离度（Rs）均用来评价不同色谱条件下对映体拆分的效果。若需要在色谱系统上达到良好的分离度Rs，则需要评估所选用色谱系统中目标化合物的k1、k2值及α值，其中k1、k2值更多与色谱系统的固定相、流动相及温度等条件相关。因此在对映体拆分的优化过程中，对固定相、流动相（改性剂）的选择以及有可能影响化合物色谱保留的SFC背压和柱温条件进行研究。

选择了Chiral-pak IC-3［3.0 mm×150 mm，3 μm，固定相纤维素-三（3，5-二氯苯基氨基甲酸酯），Daicel］、Chiral-pak AD-H［4.6 mm×250 mm，5 μm，固定相直链淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯），Daicel］、Chiral-pak ID-3（3.0 mm×150 mm，3 μm，固定相直链淀粉-3-氯苯基氨基甲酸酯，Daicel）3款手性色谱柱及一款常规反相色谱柱CAPCELL PAK MGⅢ C₁₈（2.0 mm×150 mm，3 μm，固定相C₁₈，Shiseido）作为对比。流动相总流速设置为2 mL/min，分别使用甲醇、乙腈、异丙醇、乙醇作为改性剂，改性剂梯度比例根据不同色谱柱进行调整以达到合适的保留时间（1.5～6.5  min）。对比了甲胺磷对映体和乙酰甲胺磷对映体在相应色谱条件下的分离度Rs。

表1为各柱在不同改性剂条件下的保留因子、分离因子及分离度。在常规反相柱（MGⅢ）上，使用甲醇、乙醇和乙腈作为改性剂时化合物在柱上无保留，且在部分改性剂（异丙醇）条件下甲胺磷和乙酰甲胺磷的对映体不能有效分离（Rs<1）。在使用手性固定相的情况下，在以直链淀粉-3-氯苯基氨基甲酸酯为固定相的ID-3柱以及以直链淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）为固定相的AD-H柱上，甲胺磷对映体均不能有效分离。在IC-3柱上使用甲醇、乙醇作为改性剂时，乙酰甲胺磷对映体也不能得到分离，对比使用乙腈和异丙醇的情况（图1），在乙腈作为改性剂时，色谱基线较高，杂质峰明显，虽分离度比使用异丙醇时略有提高，但依然不能达到后续工作的要求；在异丙醇作为改性剂时，两对对映体达到有效分离，Rs均不低于1.5，同时基线平稳，无明显干扰峰。因此，选择IC-3手性柱作为分离介质，异丙醇作为SFC改性剂。