青石斑幼鱼致病病原哈维氏弧菌的分离鉴定及致病性分析

摘要 为阐明哈维氏弧菌对青石斑幼鱼的致病特性，开展了人工感染试验，注射感染健康青石斑幼鱼14 d，其半致死剂量（LD50）为6×105 CFU/mL。毒力基因分析表明，该菌株携带鞭毛结构基因flaB、flaC，溶血素基因vhhA、vhhB，群体效应调节基因luxR和几丁质酶基因chiA 6个毒力基因。耐药性分析表明，菌株TJYG-42对甲硝唑（MTZ）、链霉素（S）、阿莫西林（AMX）和氨苄西林（AM） 4种药物具有抗性。组织病理学分析表明，菌株TJYG-420感染引起了鱼体组织明显的病理变化，包括皮肤组织中囊状细胞数量明显增加，鳃细胞增生、肿胀、毛细血管扩张，肠黏膜断裂破损，部分绒毛脱落，肝脏细胞空泡化等。这些研究结果将为养殖青石斑鱼细菌性疾病的防治提供理论基础。

关键词 青石斑鱼；哈维氏弧菌；耐药性；毒力基因；组织病理学评估

中图分类号 S 941  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）12-0089-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.020

Identification and Pathogenicity Analysis of Vibrio harveyi from Juvenile Yellow Grouper （Epinephelus awoara）

GUO Mei-ling，PANG Yue，LIU Xin-rui et al

（College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract In order to elucidate the pathogenic characteristics of the V.harveyi isolate on juvenile yellow grouper，we conducted artificial infection experiments using intraperitoneal injection and the LD50 was determined as 6×105 CFU/mL in 14 days.The virulence gene analysis showed that the V.harveyi isolate carried 6 virulence genes，including flagellin （flaB、flaC），protease （chiA），hemolysin （vhhA、vhhB），population sensing system （luxR）.Antibiotic susceptibility analysis showed that the V.harveyi isolate was susceptible to most antibiotics and resistant to only four drugs，including metronidazole（MTZ），streptomycin（S），amoxicillin（AMX） and ampicillin（AM）.Histopathological analysis showed that the infection of the V.harveyi isolate caused obvious pathological changes in fish tissues，including more sacciform cells which cytoplasmic content formed an eosinophilic clump in the centre presented in skin tissues; cellular swelling vacuolation inflammatory infiltrating and angiotelectasis in gill lamellae; blunted，fused or shed intestinal villi and loosened mucous layer and connective tissues in intestine; cellular vacuolation in liver.The results suggest that the V.harveyi isolate is the causative pathogen causing massive mortalities in juvenile yellow grouper，carries a high number of virulence genes，is susceptible to most antibiotics，and its infection caused severe histopathological changes in the fish.These results of these studies will provide technical supports for the control of bacterial diseases in cultured yellow grouper.

Key words Vibrio harveyi;Epinephelus awoara;Drug resistance;Virulence genes;Histopathological analysis

基金项目 天津市海水养殖现代农业产业技术体系创新团队项目（ITTMR-S2022006）；天津市劳模创新团队项目。

作者简介 郭美玲（1996—），女，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向：水产病害学。*通信作者，研究员，从事水产病害学研究。

收稿日期 2023-01-05

青石斑（Epinephelus awoara）是我国重要的海水养殖经济鱼类，随着养殖规模的扩大及养殖环境的恶化，养殖青石斑疾病频发，给养殖企业造成了较大的经济损失。弧菌是海水养殖鱼类的主要致病病原，隶属于弧菌科弧菌属，常见于海水中。近年来，弧菌引起的鱼类疾病越来越多。据报道，多种弧菌可以感染海水养殖鱼类，如副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）［1］、拟态弧菌（V.mimicus）［2］、哈维氏弧菌（V.harveyi）［3］、溶藻弧菌（V.anguillarum）［4］等。近年来，关于哈维氏弧菌感染海水养殖鱼类的研究报道较多。哈维氏弧菌（vibrio harveyi）是一种海洋革兰氏阴性发光微生物，生活在河口和海洋栖息地，需要氯化钠［5］。该细菌是养殖水生鱼类的一种重要病原体，可以感染多种水生鱼类。患病鱼体的常见临床症状包括皮肤溃疡、鳞片脱落、肌肉坏死和鳃盖上的结节等。研究表明，不同分离株的哈维氏弧菌，其致病特性存在差异。笔者对哈维氏弧菌的新分离株进行了致病性研究，将为阐释哈维氏弧菌的流行及为养殖青石斑细菌性疾病的预防和控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料 青石斑幼鱼购自天津某海水工厂化养殖场，体长8～12 cm，养殖水温（22±1）℃，盐度（25‰～26‰）。

1.2 人工感染试验

健康青石斑幼鱼在实验室暂养5 d后，随机分为7组，6组为试验组，1组为对照组，每组10尾鱼。采用腹腔注射的方式，试验组注射不同浓度梯度（4.7×107、4.7×106、4.7×105、4.7×104、4.7×103、4.7×102 CFU/mL）的TJYG-420菌悬液，注射剂量0.1 mL/尾。对照组注射同剂量0.7 % NaCl溶液。观察并记录鱼体发病症状及死亡情况。取濒死青石斑幼鱼的体表、肝脏、脾脏、肾脏等器官组织，再次分离纯化细菌，并进行鉴定。按照寇氏法计算病原菌对青石斑幼鱼的半致死剂量（LD50）。

1.3 菌株TJYG-420的鉴定

1.3.1 生理生化特性。

采用弧菌科和肠杆菌科生化鉴定管（购自杭州微生物试剂有限公司）测定细菌的生理生化特征。参照《常见细菌系统鉴定手册》［6］和《伯杰氏细菌鉴定手册》［7］生化指标分析菌株特征。

1.3.2 分子生物学鉴定。

按照细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）的方法提取DNA作为模板。引物（表1）由生物工程（北京）股份有限公司合成。PCR反应体系（50 μL）：20 mmol/L正反向引物4 μL，2×Taq MasterMix酶（购自北京博迈德基因技术有限公司）25 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。扩增程序：94 ℃，3 min，94 ℃，30 s、55 ℃，30 s、72 ℃，1 min，35个循环，72 ℃延伸7 min。测序结果利用MEGA11软件采用邻接法进行系统进化分析。

1.4 毒力基因检测 试验选取了11种毒力基因，包括鞭毛蛋白（flaA、flaB、flaC）、溶血素（vhhA、vhhB、hlyA）、毒力调控基因（toxS、toxR）、锌金属蛋白酶（pap6）、群体效应调节基因（luxR）、几丁质酶基因（chiA）。PCR扩增采用25 μL反应体系，扩增程序：94 ℃，3 min，94 ℃，30 s、58 ℃，30 s、72 ℃，1 min，35个循环，72 ℃延伸7 min。根据Primer Premier 5.0软件自行设计引物，其序列见表1。

1.5 耐药性分析

试验选取29种药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）测定细菌对各种抗菌药物的敏感性［10］。

1.6 组织病理分析

分别取健康和注射感染菌株TJYG-420 12 h青石斑幼鱼的皮肤、鳃丝、肠道和肝脏组织，用4%多聚甲醛溶液固定液固定，组织切片制备等参照文献［11］。

2 结果与分析

2.1 人工感染 在整个试验过程中，对照组鱼活动及进食正常，无发病或死亡情况出现。注射高浓度菌液组的鱼体死亡率为100%，而其他组的死亡率分别为30%、10%和0，经计算LD50为6×105 CFU/mL。从发病鱼体内脏中分离获得优势菌，经鉴定为哈维氏弧菌。

2.2 生理生化鉴定

菌株TJYG-420的生理生化鉴定结果见表2。菌株TJYG-420能利用葡萄糖、蔗糖和甘露糖，发酵产气，分解尿素，能在3%～6% NaCl中生长，而在8%～10% NaCl不生长。经比对，发现其生理生化特征与哈维氏弧菌基本保持一致，初步判定为哈维氏弧菌。

2.3 分子生物学鉴定

经16S rRNA基因和hsp60基因分别扩增得到大小约1 500 bp和532 bp的片段。将菌株TJYG-420的16S rRNA和hsp60基因序列在NCBI上进行同源性检索并构建系统发育树，结果显示（图1），菌株TJYG-420与哈维氏弧菌聚为一支，进一步确定TJYG-420菌株为哈维氏弧菌。

2.4 毒力基因分析

11种毒力基因检测结果显示（图2），菌株TJYG-420携带flaB、flaC、vhhA、vhhB、chiA和luxR 6个毒力基因。

2.5 耐药性分析

耐药性检测结果见表3，在抗菌药物中，菌株TJYG-420对阿奇霉素（AZM）、氯霉素（C）、奈替米星（NET）、哌拉西林（PIP）、庆大霉素（GM）、四环素类、喹诺酮类、硝基呋喃类以及头孢类等药物表现敏感，对甲硝唑（MTZ）、链霉素（S）、阿莫西林（AMX）和氨苄西林（AM） 4种药物呈耐药性。