解淀粉芽孢杆菌产酶特性及其抑制禾谷镰刀菌性能研究

摘要 ［目的］深入了解生防菌发挥作用的方式。［方法］对从土壤中分离的解淀粉芽孢杆菌的产酶活性和生防菌功能展开研究，采用产生透明圈的方法检测解淀粉芽孢杆菌生产纤维素酶的功能，用牛津杯法检测解淀粉芽孢杆菌对植物致病菌禾谷镰刀菌的抑制作用。［结果］解淀粉芽孢杆菌能够产生分解纤维素的纤维素酶，纤维素酶活性可以达到26.86 U/mL，并且它能够抑制禾谷镰刀菌的生长，而且生长代谢产物浓度越浓抑制效果越明显，未经稀释的菌液抑菌效价可达到465 mm/mL。［结论］该研究为解淀粉芽孢杆菌的实际应用提供了理论基础和实践指导。

关键词 抑菌性能；解淀粉芽孢杆菌；禾谷镰刀菌；纤维素酶；生防能力

中图分类号 X172  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）14-0011-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.003

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作者简介 董丽丽（1973—），女，山东威海人，高级工程师，从事风景园林建设管理、环境微生物应用研究。

随着人类人口数目的不断增加，人们对农作物的需求也随之增加，这促使农田面积大幅度增加，大量种植所需求的农作物。然而，大面积开垦农田，种植单一作物，使得生态系统的多样性下降，稳定性下降，对于各种病虫害的抵御能力也随之下降［ 1］。病虫害带来的巨大经济损失使得人们对这一问题越来越重视，随着技术的不断进步，研究者发现有些化学试剂能够有效地抑制病虫害，减少农作物的损失，有些化学试剂能够通过提供生长所需要的元素来提高农作物的产量，于是就出现了化肥农药。正是由于化学防治的高效性，截至目前，人们大多仍采用此方法来抵御农作物的病虫害。但是无节制地使用化肥农药，也造成环境污染、土壤硬化等问题［ 2］。并且病原微生物也因为化学药剂的使用而产生了不可避免的抗性［ 3］，再加上近年来人们对生活质量的追求，以及农药残留带来的食品安全问题，农田防治病虫害的方法也日益受到人们的关注，所以在这种趋势下化学防治在农业方面的应用也慢慢减少。

近年来，在研究防治病虫害的过程中，人们发现有些微生物也具有防治的功效，由于生物防治具有无害性这一特点，对生物防治的研究也越来越受关注［ 4］。农药减量化观点的提出也使人们不断去寻找其他能够替代农药作用的方法，人们对作为能够无害解决病虫害问题的生物防治的方法充满期待［ 5］。相关研究表明生防菌可以作为化学农药的良好替代品，它不仅能够解决病虫害问题，而且不会给环境造成污染。某些生防菌还可以抑制农田中杂草的生长［ 6］，这种微生物除草剂主要是利用杂草病原微生物的致病能力从而达到除草的目［ 7］。此外，对药用植物有关的生防菌的研究也是一大热点［ 8］。药用植物相比于一般的植物，它对光照、温度、湿度等环境因素的要求更加苛刻，所以人们更加关注药用植物的培育［ 9］。对于某些珍贵的药用植物，生防菌的存在提升了自身的存活率。木霉属（Trichoderma spp.）、芽孢杆菌属（Bacillus spp.）、假单胞菌属（Pseudomonas spp.）等是植物生防菌中较为常见的类型［ 10］，其中生防菌中的细菌是应用最为广泛的一种［ 11］。这些生防菌发挥作用的机制主要是抗生作用、竞争作用、重寄生作用、诱导植物系统抗性等拮抗机制［ 12］。

其中，芽孢杆菌是研究的一大热点，芽孢杆菌是微生物中的优势生物种群，它是一种严格好氧、兼性厌氧的杆状菌。芽孢杆菌最大的特点是能够产生圆形或者椭圆形的芽孢，并且因为有芽孢的存在使得它具有极强的环境适应力，能够在酸性、高温、低氧、紫外线、电离辐射和存在有害化学试剂等各种不良环境下存活［ 13］。芽孢杆菌生长速度很快，体积也比一般的病原菌大，所以它可以通过和其他病原菌竞争生长空间、争夺养分的方式，抑制病原菌的繁殖生长，此外，芽孢杆菌还可以产生一些抗菌物质，具有更好的抑菌效果，还可以分泌一些能够促进植物生长的物质，可促进植物生长，最重要的是对人畜无害［ 13］。该研究从土壤中筛选并鉴定解淀粉芽孢杆菌，采用牛津杯法检测所筛解淀粉芽孢杆菌对植物病原菌的抑制作用，并且通过观察水解圈的大小来鉴定它产纤维素酶的能力，以期为该菌作为土壤改良剂提供应用基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种。解淀粉芽孢杆菌（从土壤中分离得到的）；植物病原菌禾谷镰刀菌（从谷镰刀病的玉米病株中分离得到的）。

1.1.2 试剂。酵母提取物，羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium-Na，CMC-Na），胰蛋白胨，（NH4）2SO4，NaCl，琼脂粉，葡萄糖，K2HPO4，Mg SO4·7H2O，CaCl2，1% CMC溶液，DNS溶液。

1.1.3 培养基。

（1）LB固体培养基。胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，琼脂粉 15 g，pH为7.2。

（2）LB液体培养基。胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，pH为7.2。

（3）马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。马铃薯提取物（将200 g 马铃薯去皮切成薄片，用适量蒸馏水煮熟，再用8层干净的纱布进行过滤得到的滤液），琼脂粉 15 g，葡萄糖 20 g，再用蒸馏水定容到1 L。

（4）马铃薯葡萄糖水（PD）培养基。马铃薯提取物，葡萄糖 20 g，蒸馏水定容到 1 L。

（5）纤维素酶测定培养基。（NH4）2SO4  0.25 g，K2HPO4  0.3 g，Mg SO4·7H2O 0.05 g，羧甲基纤维素钠 1 g，琼脂2 g，蒸馏水定容100 mL，pH为7.2。

（6）产纤维素酶培养基。CMC-Na 1.5 g，（NH4）2SO4 0.2 g，蛋白胨 0.1 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4  0.4 g，CaCl2 0.03 g，蒸馏水定容到100 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的分离筛选。

称取10 g土壤用90 mL的无菌水溶解摇匀，用盛有9 mL无菌水的试管进行梯度稀释，依次为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，充分混匀，并做好标记。分别吸取1 mL 10-5、10-6、10-7、10-8试管中的混合溶液，每个试管中的溶液分别涂布到2个制备好的LB固体培养基中，做好标记。38 ℃恒温培养箱中培养1 d。从培养的平板中再次挑菌，接种到新的LB固体培养基中，纯化重复2～3次。

1.2.2 PCR扩增和16S rDNA琼脂糖凝胶电泳。

取纯化的菌株放入有50 μL双蒸水的离心管中，摇晃混匀；离心管用泡沫浮板固定，放到提前预热到100 ℃的水浴锅中，煮沸10 min，将处理过的菌液置于离心机中，5 000 r/min，离心10 min，取上清液。

将离心取得的上清液与dNTP、buffer、Taq酶和引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），以及双蒸水按照标准配制成25 μL的体系［10×缓冲液2.5 μL，dNTP 2.5 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.25 μL，2种引物（27F和1492R）各1 μL，双蒸水补至25 μL］，将混合好的体系放到无菌的EP管中，用漩涡振荡仪混合均匀。设置PCR仪程序（95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min），进行PCR扩增。

将0.2 g琼脂糖和20 mL电泳液加热混合均匀，待混合液的温度下降至40 ℃左右加入2 μL核酸染料混合均匀后倒入模具中，待凝胶凝固后放入电泳池中。取4 μL PCR产物与等量的londing buffer混合均匀，用移液枪转移到电泳池的凝胶孔中，110 V电泳40 min，结束后使用凝胶成像系统观察电泳结果。保存条带在1 500 bp左右的PCR产物，送至青岛蔚来生物科技有限公司进行测序，得到菌株（K3菌）的16S rDNA扩增片段序列。

应用NCBI上的BLAST功能对所得到的序列进行同源分析，并利用MEGA6软件构建系统发育树。

1.2.3 产纤维素酶性能测定。

①将K3菌分四区接种到纤维素酶测定培养基中，置于37 ℃恒温箱培养1 d。

②向培养基中加入适量的2%刚果红溶液，染色15 min后，用蒸馏水和1 mol/L NaCl溶液进行清洗，观察菌种周围有无水解圈。若存在水解圈，测量水解圈的直径。

③挑取菌种接种到产纤维素酶培养基中，置摇床37 ℃培养1 d。12 000 r/min离心10 min。

④取2次0.5 mL上清液分别置于A、B管中，A管用50 ℃水浴锅预热，B管100 ℃灭活。取出，A、B管同时加入1.5 mL 1% CMC溶液，在50 ℃水浴锅中，保温30 min。取出，分别加入3 mL DNS溶液，沸水煮沸10 min，冷水降温，540 nm 波长测OD值。比对标准曲线测出葡萄糖含量，计算纤维素酶酶活。

1.2.4 抑菌性能测定。

①用接种环挑取禾谷镰刀菌接种到盛有无菌水的锥形瓶中，加入适量玻璃珠，摇晃振荡使病原菌上的孢子分散在水中，过滤得到只含有孢子的悬浮液。

②制备PDA固体培养基，在培养基冷却但是在凝固之前加入孢子悬液，并放入直径为10 mm牛津杯，凝固后取出牛津杯。

③对纯化的解淀粉芽孢杆菌进行液体培养，取菌液置于离心管中5 000 r/min离心10 min，取上清液并进行梯度稀释，取20 μL上清液依次加至牛津杯在PDA固体培养基中留下的孔中。在恒温培养箱中28 ℃培养3 d，观察是否产生抑菌圈，若有测量抑菌圈的大小，并计算抑菌效价，抑菌效价=（抑菌圈直径-牛津杯直径）/发酵液体积×1 000。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA同源性分析

分离得到的菌株（K3菌）的16S rDNA扩增片段长度为1 430 bp，如图1所示。将获得的序列片段利用NCBI的BLAST功能进行比对，结果显示筛选所得菌种与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）同源性高，初步判断此菌种为解淀粉芽孢杆菌。

应用MEGA6软件进行分析，建立系统发育树。从系统发育树（图2）可以看出，K3菌与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）在同一分支，说明两者之间存在的亲缘关系最近，所以进一步确定筛选出的K3菌为解淀粉芽孢杆菌。

2.2 产纤维素酶性能分析

纤维素酶测定培养基平板上接有菌种的4个分区尽管菌落大小不同，但是都有不同程度的水解圈。各个分区具体菌落直径以及对应的水解圈直径如表1所示，虽然有着不同大小的水解圈，但是水解圈直径与菌落直径的差值在1.0～1.3，这说明解淀粉芽孢杆菌是能够产出一定量的纤维素酶。经计算，该纤维素酶的平均酶活为26.86 U/mL。

2.3 抑制禾谷镰刀菌活性分析

从抑制病原菌生长的平板上可以明显地观察到滴加不同浓度解淀粉芽孢杆菌菌液的4个分区都产生了不同程度的抑菌圈，这说明解淀粉芽孢杆菌能够抑制病原菌禾谷镰刀菌的生长。但是由于所加入的上清液浓度变化不大，导致抑菌圈的大小变化不大。测量各浓度解淀粉芽孢杆菌菌液抑制禾谷镰刀菌产生的抑菌圈直径（表2），可以直观地看到上清液的浓度越高，抑菌圈越大，抑菌效果越好，未经稀释的菌液抑菌效价可达到465 mm/mL。