猴杰2号液体菌种发酵条件研究

摘要 以猴头菌株猴杰2号母种为材料，研究其液体菌种最佳发酵条件，为其大规模栽培生产提供参考。采用单因子试验结合正交优化试验，以发酵所得菌丝球平均干重为衡量指标，并对所有平行数据进行SPSS方差分析，研究猴杰2号菌株液体发酵的最佳碳源、氮源、无机盐及生长因子营养组合，以及最佳初始pH、摇床转速、摇瓶装液量、摇瓶中玻璃珠数等摇床培养条件组合。结果表明，猴杰2号菌株液体发酵的最佳培养基组合为麦芽糖2%+蛋白胨0.3%+磷酸二氢钾0.225%+硫酸镁0.075%+维生素B1 20 mg/L，菌丝球平均干重可达8.33 g/L；最佳摇床培养条件组合为初始pH 5.0、转速160 r/min、装液量120 mL/250 mL、玻璃珠5颗/瓶，菌丝球平均干重可达8.50 g/L。

关键词 猴杰2号；液体发酵；正交优化；培养基组合；摇床培养条件

中图分类号 S646.9  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）14-0043-05

基金项目 武汉生物工程学院2021年校级教学改革研究项目（2021J05）；2022年湖北省大学生创新创业训练计划项目（S202212362020X）。

作者简介 唐业刚（1979—），男，湖北武汉人，副教授，硕士，从事食、药用菌菌种的研发与应用。

收稿日期 2022-07-08

猴头菌（Hericium erinaceus），又名刺猬菌、对脸蘑、山伏菌等，是著名的食、药兼用珍稀食用菌［ 1］。其肉质鲜美，营养丰富，富含多种氨基酸和维生素［ 2-3］，素有“山珍猴头、海味燕窝”之美称。中医认为猴头性平味甘，利五脏，助消化，健脾胃，是著名的防治胃溃疡、十二直肠炎等消化道黏膜损伤的滋补品［ 4］。现代医学研究表明，猴头中的多糖和多肽类物质对小鼠肉瘤S-180和艾氏腹水瘤有明显的抑制作用，经常食用可提高人体免疫力［ 5-6］。目前，以猴头菌片、猴头饼干等为代表的猴头食、药系列产品的开发利用前景广阔，以猴头子实体或液体发酵产物中多糖、多肽等活性成分提取和纯化等研究较多，利用成熟稳定的猴头液体发酵工艺进行大规模栽培生产，已成为目前猴头菌市场开发的迫切需要。

使用猴头固体菌种进行人工栽培，是目前国内的主要栽培方式［ 7］。然而，固体菌种发菌时间长，菌丝产率低，菌龄不整齐，难以满足大规模生产栽培的需要。液体菌种则具有发酵效率高、菌龄年轻且整齐一致的优点，极其适合于大规模生产栽培的需要。

当前猴头菇液体发酵的研究主要集中在发酵条件对其多糖、多肽等药用活性成分的分离、提取及其药理学研究上［ 6，8-9］，对其液体发酵的营养条件和摇床培养条件的报道则较少。且由于不同研究者使用的出发菌株不同、试验条件亦不同等原因，目前关于猴头菇液体发酵营养条件和摇床培养条件的研究结果［ 10-14］尚不一致。笔者在《食用菌栽培实验》课程的教学过程中发现，华中农业大学食用菌菌种保藏中心的猴杰2号菌株栽培性状优秀，出菇产量和质量较好，有较大的大规模生产开发应用潜力。经中国知网（CNKI）数据库检索发现，目前尚未有对猴杰2号液体菌种发酵条件的相关报道。为此，笔者以猴杰2号菌株为对象，对其液体发酵的营养条件和摇床培养条件进行研究，以期为猴头2号菌株液体菌种应用于大规模生产栽培以及其液体发酵产物中多糖、多肽等活性成分的提取、纯化及其后续药理学研究等开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与主要仪器设备

①供试猴头母种。猴杰2号菌株，购自华中农业大学食用菌菌种保藏中心。

②主要试剂。琼脂粉、麦芽糖、VB1、可溶性淀粉、无水葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、乳糖、蛋白胨、酵母浸粉、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾。③主要仪器设备。SW-CJ-1F型单人双面净化工作台、DHP-9052型电热恒温培养箱 、202-0B型干燥箱、P270A型普通摇床、手提式高压灭菌锅、PHS-3C型酸度计、电子天平、发酵用玻璃珠。

1.2 试验方法

1.2.1 母种活化与扩繁。

将所购母种于25 ℃下暗培养3 d活化后，按1∶20于母种转管培养基（PDA，5%柠檬酸调pH至6.0）［ 15］中转管扩繁，每隔3 d观察一次转管结果，并挑选菌丝洁白、粗壮的满管母种试管备用。

1.2.2 一级摇瓶种子的制备。

配制一级摇瓶液体种子培养基［ 12-14］：黄豆粉1%，蛋白胨0.1%，葡萄糖2%，KH2PO4 0.15%，MgSO4 0.075%，VB1 10 mg/L，pH 6.0，按120 mL/250 mL装液量分装于锥形瓶中。121 ℃高温高压蒸汽灭菌30 min后，于超净台中将“1.2.1”所得母种，钩取5块尽量少带琼脂的菌丝块，接入锥形瓶中。25 ℃暗光下静置1 d后，暗光下于25 ℃、150 r/min摇床上发酵培养，6 d后观察并记录一级摇瓶种子培养结果，挑选发酵母液澄清、菌丝球直径约2 mm且大小均匀的一级摇瓶种子备用。

1.2.3 发酵培养基最佳碳源、氮源的单因子筛选。

以碳源（葡萄糖）3%＋氮源（酵母粉）0.2%＋KH2PO4 0.15%＋MgSO4 0.075%＋VB1 10 mg/L，pH 6.0为液体菌种的基本培养基，采用单因子试验，筛选最佳碳源、氮源的种类。其中，供试碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖。供试氮源为蛋白胨、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、麸皮（由于麸皮不溶于水，考虑到其有机氮的有效添加量，采用20 g/L浓度添加，具体方法为煮沸30 min后取滤液进行添加）。各试验组均做5次平行重复，均采用120 mL/250 mL装液量分装，121 ℃高温高压灭菌30 min后备用。

取“1.2.2”所得一级液体摇瓶种子，按6％接种量分别接种到上述碳源、氮源培养基中，于25 ℃暗光下置于150 r/min摇床上培养。6 d后观察摇瓶发酵结果，并用8层纱布过滤发酵液，所得菌丝球用蒸馏水反复冲洗后，于80 ℃烘箱中烘干2 d至恒重，称重，计算各试验组发酵所得的菌丝球平均干重（g/L）。

1.2.4 液体菌种发酵培养基的正交优化试验。

为研究各营养因子的互作，以“1.2.3”所得最佳碳源（A）、最佳氮源（B）、磷酸二氢钾（C）、维生素B1（D）为因子，按表1因素水平，进行L9（3）4正交优化试验设计，筛选最佳液体发酵培养基。

分别配制由表1所得的9种正交优化培养基，均按120 mL/250 mL装液量分装，121 ℃高温高压灭菌30 min后，于超净台上分别按6%的接种量接入“1.2.2”所得一级摇瓶种子，于25 ℃暗光下，置于150 r/min摇床上摇瓶培养，6 d后结束发酵，并按“1.2.3”中的方法，记录并测定各试验组的菌丝球平均干重   （g/L），上述9组培养基均做5次平行重复。

1.2.5 液体菌种摇床培养条件的单因子试验。

以“1.2.4”所得最佳正交优化培养基为配方，分别进行以下摇床培养条件的单因子试验。

（1）初始pH的筛选。分别调整培养基的初始pH至4.0、5.0、6.0、7.0，每组pH均平行重复5次，均采用120 mL/250 mL装液量分装，121 ℃高温高压蒸汽灭菌30 min后，均按“1.2.3”中的接种、培养和菌丝球平均干重测定方法，计算各组菌丝球平均干重（g/L）。

（2）摇瓶装液量的筛选。分别在250 mL锥形瓶中分装80、100、120、140 mL培养基，每组平行重复5次，各组初始pH均调至6.0，121 ℃高温高压蒸汽灭菌30 min后，均按“1.2.3”中的接种、培养和菌丝球平均干重测定方法，分别按照不同装液量换算，计算各组菌丝球平均干重（g/L）。

（3）摇床转速的筛选。将培养基的初始pH均调至6.0，均采用120 mL/250 mL装液量分装，121 ℃高温高压蒸汽灭菌30 min后，按“1.2.3”中的方法进行接种后，25 ℃暗光下，分别置于120、150、180、210 r/min摇床上发酵，每个梯度均平行重复5次，6  d后按“1.2.3”中的方法测定菌丝球平均干重（g/L）。

1.2.6 液体菌种摇床培养条件的正交优化试验。

鉴于在摇瓶发酵液中添加玻璃珠有利于分散菌丝，造成更多萌发点［ 15］，同时结合“1.2.5”单因子试验结果，以pH（A）、装液量（B）、转速（C）、摇瓶中的玻璃珠（直径0.5 cm）颗数（D）为因子，按表2因素水平表，进行 L9（3）4正交优化设计，考察各摇床培养条件之间的相互作用。上述9组试验组均平行重复5次，筛选最佳摇床培养条件。

配制“1.2.4”中的优化培养基，按由表2所得9组正交优化试验组合，分别调整培养基的初始pH，并按不同装液量分装，121 ℃高温高压蒸汽灭菌30 min后，分别按6%接种量接入“1.2.2”所得一级摇瓶种子，于25 ℃暗光下，置于不同转速摇床上发酵培养，6 d后结束发酵，并按“1.2.3”中的方法，计算各组菌丝球平均干重（g/L）。

1.3 数据分析

试验所得各平行数据，均采用SPSS 22.0软件进行方差分析，判断各试验处理组之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 培养基碳源、氮源的筛选结果

由图1可知，麦芽糖结果最优，乳糖结果最差，但除乳糖外的其余4组碳源种类之间无显著差异，这表明猴杰2号可以利用的碳源种类较多。从生产成本考虑，可选用价格相对低廉的可溶性淀粉作为碳源进行大规模发酵。

由图2可知，蛋白胨和酵母粉的发酵结果均显著高于其他组，且该2组之间无显著差异，这表明猴杰2号可以高效利用动物源性和微生物源性有机氮。其余3组中，尿素组发酵结果显著低于其他组，这可能与尿素在培养基灭菌中发生了分解有关［ 2］；硫酸铵组发酵结果也较差，仅显著高于尿素，这表明猴杰2号难以利用无机氮。

麸皮组发酵结果显著低于蛋白胨和酵母粉组，但又显著高于无机氮组。这表明猴杰2号对植物源性有机氮的利用效果不及蛋白胨和酵母粉组。麸皮的发酵效果显著高于无机氮组，一方面可能是猴杰2号菌株相较于无机氮，更偏好利用植物源性有机氮；另一方面，由于麸皮不能溶于水，需要在水中煮沸30 min后取其滤液添加到培养基中，考虑到其有效氮源添加量，对麸皮的添加量进行了放大处理。因此，也有可能是麸皮在试验中的添加量（2%）高于尿素、硫酸铵（0.2%）所致，具体原因则有待于进一步研究。

综上，分别选择单因子试验数据最高的麦芽糖和蛋白胨作为碳、氮源种类，参与后续的正交优化试验。

2.2 培养基的正交优化试验结果

由表3可知，3号试验组（A1B3C3D3）的菌丝球平均干重最大，显著高于其他组；由极差（R）值可知，各因子的主次优先顺序为B（蛋白胨）>D（维生素B1）>C（磷酸二氢钾）> A（麦芽糖）；由k值可知，正交试验的最优结果为A3B3C3D3，这与3号试验组（A1B3C3D3）的结果不一致，需进一步做二者对比的验证试验。

2.3 正交优化试验的验证补充试验

分别配制“2.2”中所得的需要进行验证试验的A1B3C3D3和A3B3C3D3这2种培养基（各5瓶），按“1.2.3”试验方法，分别测定二者的菌丝球平均干重（g/L），并按“1.3”的方法，进行差异显著性分析。

验证试验结果显示，A1B3C3D3培养基的菌丝球平均干重为8.13 g/L，A3B3C3D3培养基所得菌丝球平均干重为7.85 g/L，进一步方差分析结果表明，A1B3C3D3显著高于A3B3C3D3。

综上，A1B3C3D3（麦芽糖2%+蛋白胨0.3%+磷酸二氢钾0.225%+硫酸镁0.075% +维生素B1 20 mg/L）为该试验条件下的最佳培养基组合。