基于COI基因分析叶尔羌河5种鲤科鱼类遗传多样性

摘要 ［目的］探讨线粒体COI基因对叶尔羌河鱼类资源鉴定及遗传多样性分析的适应性。［方法］分析叶尔羌河5种鲤科的50条COI基因片段序列，并结合GenBank比对筛选出的12条高同源序列基于邻接法构建系统进化树。［结果］5种鱼类COI基因同源序列的长度675 bp，碱基组成展现出显著A/T的偏倚性，转换/颠换的比值（R值）为3.2；核苷酸变异位点有146个，定义了10个单倍型；除塔里木裂腹鱼和宽口裂腹鱼物种间的遗传距离（0.002 4），其余物种间的遗传距离均符合2%阈值或10倍原则；系统进化树中，除塔里木裂腹鱼和宽口裂腹鱼外，斑重唇鱼、鲫鱼和鲤鱼均形成独立分支，推测两者亲缘关系较近或物种间未达到分化程度。［结论］COI基因适用于叶尔羌河除裂腹鱼属外鱼类的物种鉴定及多样性分析。

关键词 COI基因；鲤科鱼类；遗传多样性；叶尔羌河

中图分类号 S 931.3  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）16-0086-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.16.021

Genetic Diversity of Five Cyprinidae Fishes in Yarkant River Based on COI Gene

ZHANG Xiao-yu，JIN Wen-hui，WANG Jia et al

（College of Life and Geographic Sciences，Kashi University/Key Laboratory of Biological Resources and Ecology in Pamir Mountains，Xinjiang，Kashi，Xinjiang 844000）

Abstract ［Objective］To explore the adaptability of mitochondrial COI gene to fish resource identification and genetic diversity analysis in Yarkant River.［Method］ 50 COI gene fragment sequences of 5 species of Cyprinidae in Yarkant River were analyzed，and the phylogenetic tree was constructed based on the neighbor-joining method combined with 12 high homologous sequences screened by GenBank alignment.［Result］The length of COI gene homologous sequence of 5 fish species was 675 bp，showing significant base bias，and the conversion/transmutation ratio （R value） was 3.2.There were 146 nucleotide mutation sites and 10 haplotypes were defined.Except for the genetic distance between Tarim schizostomus and wide-mouth schizostomus species （0.002 4），the genetic distance between other species conforms to the 2% threshold or 10-fold principle.In the phylogenetic tree，except for schizostomus Tarim and schizostomus broadmouth，all of them formed independent branches，suggesting that the two species were closely related or did not reach the degree of differentiation.［Conclusion］COI gene was suitable for species identification and diversity analysis of fishes except schizothorax in the Yarkant River.

Key words COI gene; Cyprinid fish;Genetic diversity;Yarkant River

基金项目 新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室开放课题（XJDX114-2021-10）。

作者简介 张小雨（1997—），女，安徽合肥人，硕士研究生，研究方向：动物生态与分子进化。通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事动物生态与分子进化研究。

收稿日期 2023-03-03

叶尔羌河位于新疆塔里木盆地的西南面，起源于世界第二大高峰——乔戈里峰，属于塔里木河水系［1-2］。流域内分布的鱼类主要为鲤形目的鲤科和鳅科，土著鱼以高原鳅属和裂腹鱼属为主，普通经济鱼类由鲤鱼、草鱼、鲫鱼等构成［3］。目前，与叶尔羌河流域相关的研究日益增多，主要集中在水利水电工程［4］、环境科学和资源利用［5］等方面，但从分子水平对该流域鱼类资源状况的研究鲜见报道。因此选取适宜的方法对该流域鱼类资源进行鉴定及进一步的系统进化分析极为重要。

王德忠［6］、杨天燕等［7］、陈生熬等［8］均通过形态学的方法分别分析了新疆裂腹鱼的分布特性和遗传差异以及叶尔羌高原鳅的种群结构。李国刚等［9］也曾对塔里木河等水系的土著鱼类资源展开调查，发现了水系的特有鱼类。随着种质资源鉴定技术的进一步发展［10］。其中，COI（线粒体细胞色素C氧化酶亚基 Ⅰ ）基因的引物通用性和进化速度［11］均处于较高水平，而且它的5′端序列的种间差异显著高于种内，所以，mtDNA基因被视为物种鉴定的理想基因条形码之一［12］。2003年，Hebert等［13］首次提出COI基因可以作为基因条形码对物种进行有效鉴定的观点。此后，Gomes等［14］利用COI基因对爬行类物种和鱼类进行鉴定，说明COI基因作为遗传标记鉴定物种的有效性。闫亚利等［15-17］也选择COI基因对鱼类种质鉴定进行研究。该研究基于COI基因序列对叶尔羌河流域5种鲤科鱼类的遗传多样性进行分析，探讨COI基因作为分子标记对叶尔羌河鱼类进行鉴定的有效性和适应性，有助于对叶尔羌河鱼类资源状况展开调查，为该流域鱼类资源的合理开发及利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从塔什库尔干县、麦盖提县等地的叶尔羌河流域采集鱼类样品共50尾。参照《新疆鱼类志》［18］对采集的鱼类样本进行形态学初步鉴定，拍照记录每个样本，并剪取鱼鳍组织浸泡于95%无水乙醇，分组编号后保存于-80  ℃冰箱。

1.2 DNA提取、扩增及测序

利用传统的酚-氯仿法，提取叶尔羌河5种鱼类鱼鳍或鱼肉组织的DNA。该研究相关引物采用鱼类通用引物（FISH-F1：5′-TCAACCAACCACAAAAAGACATTGGCAC-3′;FISH-R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′;FISH-F2：5′-TCGACTAATCATAAAGGATATCGGCAC-3′;FISH-R2：5′-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′）［19］扩增COI片段。PCR反应体系为20 μL，包括2×Taq PCR Mix 12 μL、上下游引物（10 mmol/L）各0.4 μL、DNA模板1 μL、ddH2O加至20 μL；PCR扩增程序：94  ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，72  ℃延伸1 min，以上步骤经35个循环之后，再72  ℃延伸5 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格后送样测序。

1.3 数据处理

使用Chromas软件查看正反双向测序结果峰图，然后使用DNAStar软件包进行序列的拼接、比对和校对；利用DnaSP 5.10软件计算叶尔羌河5种鱼类群体单倍型，并统计变异位点数、单倍型多样性指数（Hd）、核苷酸多样性指数（Pi）、核苷酸差异数（K）等；采用MEGA 7.0软件计算序列核苷酸组成和遗传距离等，并结合下载的12条同源序列（具体信息见表1）基于NJ法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 COI基因序列特征 该研究通过比对和分析叶尔羌河5种鱼类样本的COI基因片段序列，再结合从NCBI下载的12条已知的线粒体基因序列，最终保留675 bp的序列。分析结果表明（表2），叶尔羌河流5种鲤科鱼类COI基因序列的平均碱基含量分别为T 28.4%、C 28.2%、A 25.6%、G 17.8%，其中鸟嘌呤含量最低，胸腺嘧啶含量最高，且5种鱼类的COI基因片段序列的A+T含量明显高于G+C，展现出显著的A/T偏倚性。该研究序列中的变异位点146个，没有发现碱基的插入/缺失，平均转换位点和颠换位点分别为41和13，平均碱基转换/颠换（R值）为3.2。

2.2 遗传多样性分析

对叶尔羌河5种鱼类COI基因的Hd、Pi和K值进行统计（表3），共发现变异位点146个，其中包括了145个简约性信息位点，1个单一多态位点。整体的Hd、Pi和K值分别为0.838、0.079 39和53.589。在单倍型多样性指数（Hd）中，塔里木裂腹鱼最高（Hd=0.509），鲤鱼其次（Hd=0.500），均表现出较高的单倍型多样性，而鲫鱼（Hd=0.473）、斑重唇鱼（Hd=0.286）和宽口裂腹鱼（Hd=0.118）的单倍型多样性指数则较低；在核苷酸多样性指数（Pi）中，鲫鱼最高（Pi=0.003 18），宽口裂腹鱼最低（Pi=0.000 17），表明叶尔羌河5种鲤科鱼类群体的核苷酸多样性均处于较低的水平。

通过MEGA 7.0软件对叶尔羌河流域5种鱼类的遗传距离进行统计，结果表明（表4），该研究5种鱼类的种内遗传距离为0～0.003 2，平均值为0.001 6，其中鲫鱼的种内遗传距离最大（0.003 2）；种间距离为0.002 4～0.150 5，平均值为0.088 8。其中，斑重唇鱼和鲫鱼的种间遗传距离最远（0.150 5）；塔里木裂腹鱼和宽口裂腹鱼的种间遗传距离最小（0.002 4），推测与两者亲缘关系较近有关。

2.3 单倍型分析

采用DnaSP 5.10软件检测该研究中50个样本的COI片段，一共获得146个多态性位点，10个单倍型。其中，Hap1、Hap2在斑重唇鱼中特有；Hap3、Hap5在塔里木裂腹鱼中特有；Hap4在宽口裂腹鱼中特有；Hap6、Hap7、Hap8在鲫鱼中特有；Hap9、Hap10在鲤属的鲤鱼中特有。

2.4 系统进化树的构建 以黄颡鱼（Tachysurus fulvidraco，MH317141.1）作为外群，采用邻接法（neighbor-joining method，NJ）来构建系统发育树。如图1所示，该研究中的5种鱼类在系统发育树上的位置清晰，共分为4大支。其中，第一组宽口木裂腹鱼（Schizothorax eurystomus）和塔里木裂腹鱼（Schizothorax biddulphi）聚为一支；第二组鲤鱼（Cyprinus carpio）聚为一支；第三组斑重唇鱼（Diptychus maculatus）聚为一支；第四组银鲫（Carassius gibelio）、鲫鱼（Carassius auratus）聚为一支。其中，鲫属、重唇鱼属、鲤属分别单独形成一支，裂腹鱼属的宽口裂腹鱼和塔里木裂腹鱼则共聚为一大支，表明两者的亲缘系较近。

3 结论与讨论

该研究对叶尔羌河50个鱼类样本的线粒体COI基因序列进行分析，结果显示在碱基组成上，碱基T含量最高（28.4%），碱基G最低（17.8%），且碱基A+T的平均含量（54.0%）明显高于G+C的平均含量（46.0%），这与张桂宁等［17，20-21］的研究结果类似，即表现出明显的A/T碱基偏倚性，与鱼类mtDNA COI基因序列的碱基特征相符。

遗传多样性的大小通常通过Hd和Pi判断，两者的数值越大表示遗传多样性越丰富［22］。1998年，Grant等［23］首次提出以0.5作为单倍型多样性的临界值，以0.005作为核苷酸多样性的临界值。该研究中，塔里木裂腹鱼和鲤鱼均表现出较高的单倍型多样性（Hd≥0.5）和较低的核苷酸多样性（Pi<0.005），表明其可能正处于群体的快速扩张阶段［24］，任永丽［20］通过线粒体COII和ND4基因序列分析3个塔里木裂腹鱼群体发现其单倍型多样性和核苷酸多样性均较高，推测可能是由于脊椎动物不同线粒体基因序列的进化速率不同［25］或与地理隔离有关。而斑重唇鱼、宽口裂腹鱼和鲫鱼均表现出较低的单倍型多样性（Hd<0.5）和核苷酸多样性（Pi<0.005），推测其可能正经历群体瓶颈效应［26］。