基于ISSR分子标记的中华鳖种群遗传多样性分析

摘要 利用简单重复序列间扩增（inter simple sequence repeat，ISSR）分子标记技术对5种中华鳖（Pelodiscus sinensis）种群的遗传多样性以及亲缘关系进行分析。结果显示：采用筛选出的10条ISSR引物对来自5个种群的中华鳖个体样本的基因组DNA进行PCR扩增，共获得123条清晰的扩增位点，平均多态性条带（PPB）比例为73.417％。5个居群的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon多样性指数（I）分别为1.748 0、1.417 7、0.245 5、0.370 4，其中乌鳖群体的遗传多样性水平高于其他中华鳖，淮河鳖群体的变异程度最小。5个居群总遗传多样性指数（Ht）＝0.240 0±0.037 1，居群内遗传多样性指数（Hs）＝0.174 7±0.021 6，基因分化系数（Gst）＝0.271 9，基因流（Nm）＝1.339 0。总遗传变异结果显示：有27.19％的变异发生在居群间，72.81％的变异发生在居群内。杂交鳖与日本品系之间遗传一致度最高（0.937 1），遗传距离最小（0.064 9）；中国台湾品系和乌鳖的遗传距离最大（0.127 5）。聚类分析表明，杂交鳖、日本品系和淮河品系聚为一类群，乌鳖与其他品系差异较大，单独为一类群。该研究结果丰富了中华鳖分子标记信息，分析当前中华鳖遗传资源形势，为新品种选育改良、种质资源管理等提供参考资料和理论指导。

关键词 中华鳖（Pelodiscus sinensis）；ISSR；种质资源；分子标记；遗传多样性

中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）17-0072-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.17.016

Genetic Diversity Analysis of Pelodiscus sinensis Populations Based on ISSR Molecular Marker

DING Shu-quan， WU Meng-xiao， YOU Kun et al

（College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract The genetic diversity parameters and their relationship of five Chinese soft-shelled turtle （Pelodiscus sinensis） populations were analyzed by inter-simple repeat sequence （ISSR） amplification molecular marker technique. P. sinensis genomic DNA was amplified by PCR with ten selected ISSR primers， and 123 clear amplification sites were obtained. The average proportion of polymorphic bands （PPB） was 73.417%. The 5 populations’ number of alleles （Na）， effective number of alleles （Ne）， Nei’s gene diversity index （H） and Shannon diversity index （I） were 1.748 0， 1.417 7， 0.245 5， 0.370 4， respectively. The ink turtle population had the highest level of genetic diversity， while the Huaihe River population had the lowest degree of variation. The total genetic diversity index（Ht）， intra-population genetic diversity index（Hs）， gene differentiation coefficient（Gst） and gene flow（Nm） were 0.240 0±0.037 1， 0.174 7±0.021 6， 0.271 9 and 1.339 0 respectively. Total genetic variation indicated that 27.19% of the variation occurred between populations and 72.81% occurred within populations. The genetic identity between hybrid turtles and Japanese populations is the highest （0.937 1）， and the genetic distance is the lowest （0.064 9）. The genetic distance between Taiwan（China） populations and ink turtle was the largest （0.127 5）. Cluster analysis showed that the hybrid turtles， Japanese and Huai River populations were clustered into one group， and the ink turtle was quite different from others. This study enriches the molecular marker information， analyzes the current situation of genetic resources of P. sinensis， and provides reference for the breeding and improvement of new varieties and germplasm resource management.

Key words Pelodiscus sinensis;ISSR;Germplasm resources;Molecular markers;Genetic diversity

中华鳖（Pelodiscus sinensis）因其蛋白质含量丰富，药用价值高，成为我国经济价值最高，养殖规模最大的龟鳖类，2021年鳖类的养殖总产量可达364 878 t［1］。我国中华鳖种质资源丰富，但缺乏有效的亚种分化，常把不同地理种群的名作为中华鳖的同物异名；尽管在分类学中它们同属于中华鳖，但不同水系和地理居群的品系之间存在巨大的生理和性状差异。具有良好经济性状的各品系鳖可以为种质研究和良种选育提供丰富的选择性培养材料。但近年来外来鳖种的引进以及持续近交繁殖，导致中华鳖品种纯度下降与质量下滑，降低了种质间遗传多样性［2］。目前，种质资源的严重退化已成为我国中华鳖产业可持续发展的重大障碍，因此现有中华鳖种质资源的遗传多样性的统计分析工作迫在眉睫。

此前，中华鳖常基于形态学进行分类，由于性状受发育阶段和环境因素的影响，仅显示有限的变异，因此难以固定具体性状并得到稳定的良种资源［3］。近年来，分子标记技术作为种群遗传和系统发育研究中的有效手段，已成为遗传多样性评估中的重要方法，不仅有助于研究种群结构、分类问题，还能帮助种质鉴定，确定种质保护的优先级［4］。分子标记技术以聚合酶链式反应（PCR）为基础，主要包括简单重复序列间扩增（ISSR）、随机扩增多态DNA（RAPD）、简单重复序列（SSR）和扩增片段长度多态性（AFLP）［5］。ISSR作为一种基于SSR基础的分子标记技术，已被广泛应用于品种鉴定、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究［6］。谭舜等［7］建立了红尾仙女虾ISSR的反应体系。ISSR分析表明，崇明白山羊的公羊具备更高的遗传水平［8］；丹东和秦皇岛松江鲈鱼群体分化程度较低［9］；分布于广东从化的平胸龟在物种水平和居群水平的遗传多样性水平均要高于福建寿宁地区［10］。与SSR标记相比，ISSR不需要基因组序列，更加省时且经济。与RAPD和RFLP相比，ISSR除了可评估密切相关的个体之间的遗传多样性之外，还具备可靠性、多态性高、成本低及高效等特性［11-12］。

遗传多样性和变异性是生物对环境变化作出适应性反应的基础，拥有足够丰富的遗传多样性的物种在应对不断变化的环境和竞争者时具有更大的优势［13］。因此，对中华鳖种群遗传多样性以及种内、种间、种群结构的研究，为中华鳖种质资源保护提供一定的研究基础，并为新品种选育改良提供数据参考。分子标记技术以其先进的计算方法从基因层面为分析遗传多样性和了解种群系统发育关系提供了新的切入点。笔者利用ISSR技术对4个地方品系以及1个杂交品系的中华鳖进行分子标记，评估了不同品系中华鳖遗传多样性、各种群间亲缘关系和遗传结构，为辅助现有中华鳖品种选育、品种分类以及品种表征鉴定等提供基础资料，同时为中华鳖遗传资源的有效评价和利用提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验中华鳖来自5个不同居群，均由安徽省滁州市定远县绿色亲情种养殖专业合作社提供，具体特征和信息见表1。活体中华鳖运至实验室暂养3 d后取样。纱布擦拭体表，并用乙醇体表消毒后取腿部肌肉，液氮冷冻后置于-80 ℃保存备用。

1.2 DNA的提取及检测

采用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取肌肉组织基因组DNA。1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，超微量分光光度计检测核酸浓度，所提取DNA的OD260/OD280为1.70～1.94，完整度良好。

1.3 PCR扩增与电泳检测

所用引物序列来源于加拿大哥伦比亚大学公布的第九套ISSR引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。筛选出10对多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物用于扩增（表2）。反应体系为20 μL：cDNA 2.0 μL，2×Rapid Taq Master Mix 10.0 μL，引物（10 μmol/L）0.8 μL，ddH2O 7.2 μL，扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环；72 ℃彻底延伸5 min，4 ℃保存。扩增后的产物通过1.5％琼脂糖凝胶150 V电泳1 h，置于紫外凝胶成像仪中拍照保存后进行条带统计与分析。

1.4 数据统计与分析

由于ISSR为显性标记，同一引物下PCR产物电泳迁移率一致的条带代表1个等位基因位点。根据同一位点条带的有无记录电泳结果，有带的记为1，无带的记为0，将所得数据输入Excel表格构建0/1矩阵。统计总条带数、多态性位点数、多态性条带数，计算多态性条带（PPB）比例。用Popgen 32软件计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、多态性位点（PPL）比例、Nei’s基因多样性指数（H）、居群总遗传多样性指数（Ht）、Shannon多样性指数（I）、居群总遗传多样性指数（Ht）、居群内遗传多样性指数（Hs）、基因分化系数（Gst）和基因流（Nm）。用GenAlEx 6.5软件计算遗传一致度、遗传距离，并进行分子方差（AMOVA）分析。用NTSYSpc 2.10e软件以及MEGA软件构建非加权组平均法（UPGMA）品种间聚类图。

2 结果与分析

2.1 引物多态性

用筛选出的10条引物对65个中华鳖样本进行PCR，扩增结果见表2。共获得123条清晰可见的条带，其中92条条带具有多态性，平均多态性条带（PPB）比例为73.417％，每条引物平均扩增出的条带数为12.3条，多态性条带数为5～15条。引物多态性条带比例为50.00％～93.75％。其中引物UBC854多态性条带比例高达93.75％。图1为用引物UBC807扩增的电泳条带。