一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治

摘要 2021年5月，浙江诸暨某中华鳖养殖场中华鳖脖子肿胀、伸长，底板出现多处血点，并伴随大量死亡，经解剖可见腮部糜烂、充血明显，内脏呈现不同程度病变。从病鳖腮、肝、脾、肾、肠等组织分离纯化病原菌，经形态观察、生化鉴定确定其种属，并采用微量肉汤连续稀释法确定8种国标渔药对其最低抑菌浓度；同时，利用PCR方法检验是否存在病毒感染。结果显示：自有典型临床症状的中华鳖组织中分离到嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明，该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素3种抗菌药物敏感。同时，在患病中华鳖内脏中检测到一种病毒，通过测序与构建系统进化树发现该病毒与中华鳖出血性综合征病毒同源性最高且聚为一支。病原回归感染试验结果表明，分离的嗜水气单胞菌与病毒均可引起中华鳖不同程度死亡。该例中华鳖腮腺炎为嗜水气单胞菌与出血性综合征病毒混合感染所致。该研究可为中华鳖腮腺炎的科学诊断与防控提供理论依据。

关键词 中华鳖；腮腺炎；出血性综合征病毒；嗜水气单胞菌

中图分类号 S 947.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2023）18-0082-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.18.019

Diagnosis and Prevention for a Case of Parotiditis in Trionyx sinensis

ZHOU Xiu-juan1， LIANG Qian-rong2， ZHU Ning-yu2 et al

（1.Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province/College of Animal Science and Technology · College of Veterinary Medicine， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou，Zhejiang311300;2. Zhejiang Fisheries Technical Extension Center/Zhejiang Fisheries Test and Aquatic Disease Prevention Center， Hangzhou， Zhejiang 310023）

Abstract In May 2021，Trionyx sinensis in a breeding farm of T. sinensis in Zhuji of Zhejiang Province had the symptoms of swollen and elongated neck， multiple blood spots on the abdomen and highly mortality. After autopsy， obvious erosion and congestion in parotid and several pathological changes in viscera were found. The bacteria were isolated and purified from the tissues of parotid， liver， spleen， kidney and intestines of diseased T. sinensis， and were identified by morphological observation and biochemical identification. The minimum inhibitory concentrations of eight kinds of national standard fishery antibiotics were determined by micro-broth continuous dilution method. Aeromonas hydrophila was isolated from the tissues of T. sinensis with typical clinical symptoms. The drug sensitivity test showed that the bacteria was sensitive to enrofloxacin， neomycin sulfate and doxycycline hydrochloride.In addition， a virus was detected in several organs of the diseased turtles.By sequencing and phylogenetic tree construction， it was found that the virus had the highest homology with hemorrhagic syndrome virus and clustered into a branch. The results of pathogen regression experiment showed that both Aeromonas hydrophila or the virus could cause the death of T. sinensis. The parotiditis in this case was caused by the mixed infection of hemorrhagic syndrome virus and Aeromonas hydrophila. The study provided the theoretical basis for the scientific diagnosis， prevention and control of parotiditis in T. sinensis.

Key words Trionyx sinensis;Parotiditis;Hemorrhagic syndrome virus;Aeromonas hydrophila

中华鳖因其具有较高的经济价值而成为我国重要的淡水养殖品种之一。中华鳖营养丰富、肉味鲜美，具有较高的食用与药用价值［1-4］，养殖分布广泛，湖南、湖北、江西、安徽、江苏、浙江等省份产量较高［5-6］。浙江省中华鳖养殖品系众多，包括中华鳖日本品系、清溪乌鳖等，并自主繁育了中华鳖“浙新花鳖”（GS-02-005-2015）等。然而，近年来

中华鳖病害发生较多，导致养殖损失惨重。目前已报道的中华鳖病害包括病毒病、细菌病、真菌病和寄生虫病，其中病毒病和细菌病较为严重［7-9］。目前已知的中华鳖病毒主要有动脉炎病毒、黄病毒、虹彩病毒等［10-11］，细菌病病原主要为气单胞菌和弧菌［12-13］。

2021年5月，浙江省诸暨市某养殖场出现中华鳖大量死亡病例。笔者实地采集该养殖场患病中华鳖，进行组织解剖、平板划线分离优势菌，并通过细菌生理生化试验和病毒分子生物学分析的方法进行分类鉴定，再通过药敏试验筛选出能有效抑制病原菌的抗菌药物，最后提出合理防控建议，旨在为中华鳖腮腺炎的科学诊断和防控提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1

试验动物。浙江诸暨某中华鳖养殖场出现连续性死亡，病鳖行动迟缓，脖颈肿大且无法缩回壳内，底板发白，底板和四肢病鳖行动迟缓、少食厌食，脖颈肿大、无法缩回壳内，底板和四肢有明显出血点或斑块。取该养殖场5只患病中华鳖作为试验动物。

1.1.2

主要试剂。营养琼脂培养基、脑心浸出液购自青岛海博生物技术有限公司；96孔药敏板购自南京菲恩医疗科技有限公司；RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、PCR相关试剂均购自上海捷瑞生物工程有限公司；特异性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3

主要仪器。全自动细菌生理生化鉴定仪（VITEK2 Compact，法国梅里埃）；PCR仪（Arktik96，美国Thermofisher）；多功能电泳仪（PowerPac HC，美国Bio-Rad）；低温冷冻离心机（Microfuge 20R，美国Beckman Coulter）等。

1.2 病鳖解剖与病原分离

选取症状典型的濒死病鳖，无菌条件下使用接种环从其腮腺、肝、脾、肾、肠等病灶部位蘸取划线接种于营养琼脂培养基，28 ℃下培养过夜，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌（编号为SR1），保存在含20%甘油的脑心浸出液中，置于-80 ℃冰箱中保存。取肝、肾、脾等内脏组织保存于DNA/RNA保护液中，用于病毒检测。

1.3 细菌鉴定

将纯化的细菌进行革兰氏染色，根据染色结果选择相应鉴定卡，用无菌生理盐水将细菌浓度调至107～108 CFU/mL，插上鉴定卡，放入全自动细菌生理生化鉴定仪中培养鉴定。

1.4 病毒检测

利用RNA、DNA提取试剂盒分别提取病鳖肝、脾、肾组织RNA和DNA，利用中华鳖出血性综合征病毒（TSHSV）、虹彩病毒（STIV）和黄病毒（FLV）3种已知中华鳖病毒特异性引物（引物见表1，引物参考Liu等［14］、范万红等［15］报道以及经NCBI网站序列信息设计），进行PCR扩增。经1％的琼脂糖凝胶电泳初步判定扩增产物为目的条带大小附近的单一条带后，胶回收产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将测序所得的病毒序列在GenBank数据库中进行Blast比对，选取相似度高的序列，使用Clustal X进行多重序列同源性比对，使用MEGA 8.0软件采用邻接法（NJ法）构建系统进化树。

1.5 药敏试验

采用微量肉汤连续稀释法进行药敏试验。纯化的菌落用无菌生理盐水将浓度调至107～108 CFU/mL，稀释后加入96孔药敏板，28 ℃下培养24～28 h后读板。根据培养后96孔药敏板的浊度，确定恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶8种渔用抗菌药物对菌株的最低抑菌浓度（MIC值），统计8种抗菌药物对病原菌的MIC50和MIC90。

1.6 回归感染试验

1.6.1

出血性综合征病毒人工感染。按照Liu等［9］的方法，取病鳖肝、脾、肾等组织加入无菌生理盐水（质量体积比1∶10）充分研磨后12 000 r/min、4 ℃下离心10min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，并将其作为病毒粗提液进行攻毒。在（25±1）℃水温条件下，对20只平均质量300 g的健康中华鳖进行腹腔注射，每只鳖注射200 μL病毒粗提液（试验组），以等体积无菌生理盐水注射20只相同规格的中华鳖作为对照组，观察记录2组中华鳖的死亡数量，并统计累计死亡率。取感染中华鳖肝、脾、肾等组织提取核酸，进行PCR扩增，方法同“1.4”。

1.6.2

嗜水气单胞菌人工感染。取分离菌株接种于脑心浸出液，30 ℃下培养24 h，5 000 r/min离心并去除培养液后，无菌生理盐水重悬并调节浓度至107 CFU/mL。在（25±1）℃水温条件下，对20只平均质量300 g的健康中华鳖进行腹腔注射，每只鳖注射200 μL细菌悬液（试验组），用等体积无菌生理盐水注射20只相同规格的中华鳖作为对照组，观察记录2组中华鳖的死亡数量，并统计累计死亡率。从感染中华鳖腮腺、肝、脾、肾等部位蘸取划线培养并鉴定，方法同“1.2”和“1.3”。

2 结果与分析

2.1 病鳖临床症状和剖检结果