产酸菌的分离鉴定及在含氟土壤修复中的应用

摘要 以工业污水厂厌氧池活性污泥为菌源，分离到1株产酸能力较强的细菌菌株Cs-3；在实验室模拟盆栽试验条件下，用该菌株联合茶梅苗修复氟污染土壤。经过形态观察、生理生化特性及16S rDNA分析，菌株初步鉴定为沃式葡萄球菌（Staphylococcus warneri），序列号为MG755257；在最佳条件下，菌株培养液最低pH为3.51。茶梅苗不同部位对氟的吸收累积能力表现为叶＞茎＞根，叶片最高氟含量为811.97 mg/kg。添加Cs-3培养液能有效促进茶梅苗对土壤氟的富集吸收，外加2 000 mg/kg氟污染水平下，30 d修复后，添加培养液的茶梅苗叶片氟含量增加至989.68 mg/kg，土壤氟脱除率由37.24%提高至57.81%。

关键词 氟污染；产酸菌；分离鉴定；含氟土壤；富集；植物修复

中图分类号 X53文献标识码 A文章编号 0517-6611（2023）21-0083-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.21.019

Isolation and Identification of Acidproducing Bacteria and Their Application in the Remediation of Fluorinecontaminated Soil

ZHANG Baohua1， JIN Lu2， SHEN Xiaoli2

（1. Zhejiang Geological Exploration Institute of CMGB， Quzhou， Zhejiang 324000;2. College of Chemistry and Materials Engineering， Quzhou College， Quzhou， Zhejiang 324000）

Abstract Acid bacteria Cs3 was isolated from the anaerobic activated sludge which collected from a industrial wastewater treatment plant. Under laboratory simulated pot experiment conditions， the strain was used in combination with Camellia sasanqua seedlings to remedy fluorinecontaminated soil. The strain was identified as genus of Staphylococcus warneri according to 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis， serial number： MG755257. Under the optimal condition， the lowest pH of strain nutrient solution was 3.51. The ability of fluorine absorption and accumulation in different parts of Camellia sasanqua seedlings was as follows： leaf > stem > root， the highest fluorine content in leaves was 811.97 mg/kg. The addition of Cs3 nutrient solution could effectively promote the enrichment by Camellia sasanqua seedlings. Under the fluorine pollution level of 2 000 mg/kg， the fluorine content of Camellia sasanqua seedlings leaves increased to 989.68 mg/kg， and the removal rate of soil fluorine by adding Cs3 bacterial suspension increased from 37.24% to 57.81% after 30 days.

Key words Fluorine pollution；Acidproducing bacteria；Isolation and identification;Fluorinecontaminated soil;Enrichment；Phytoremediation

氟是人和动物必需的微量元素，在自然界中广泛分布，氟化工、电解铝、钢铁、磷肥等工农业生产及人类活动造成含氟化合物进入环境［1］，在土壤和沉积物中积累，影响作物生长［2］，并通过食物链对动物或人体产生危害［2-4］。调查数据显示，我国绝大多数地区存在着不同程度的地方性氟病。土壤氟污染治理及修复是值得关注的问题，目前氟污染土壤的修复除采用传统的客土法、深埋法以外，还有化学钝化、淋洗、电动修复、植物修复等技术［5-6］。

植物修复因具有高效、方便、成本低等优势，是当前土壤修复的热点。国内外研究者以土壤-植物系统为对象，对植物中有效态氟含量、富集能力、修复条件、影响因素等问题进行了广泛研究［7-9］。研究发现，茶树（Camellia sinensis）、国槐（Sophora japonica）、刺槐（Robinia pseudoacacia）、合欢（Albizia julibrissin）等植物对土壤氟具有较强的富集能力［7-8］。学者们普遍认为，植物组合技术可弥补植物单一修复技术的不足，其中利用植物-微生物联合修复是一种环境友好、前景广阔的绿色治理技术。1986年，Siegel等［10］首次报道真菌代谢作用产物能溶解重金属及其矿物，促进植物对养分及污染元素的吸收。关于产酸菌在重金属污染土壤修复中浸出、吸附等方面的应用研究有较多报道［11-13］，而其在氟污染土壤修复中的应用研究很少。2003年，徐仁扣等［14］提出低分子有机酸可通过竞争吸附作用改变土壤氟含量，从而影响土壤氟的生物有效性，这为产酸菌去除重金属以外的氟、磷等元素污染土壤的修复应用奠定了基础。

该试验从厌氧污泥中筛选分离出一株产酸菌，采用16S rRNA序列分析技术对菌株进行分子生物学鉴定，并优化其产酸条件。以茶梅苗为研究对象，通过盆栽试验，考察茶梅苗对土壤氟的吸收累积特征；同时将产酸菌应用于茶梅苗对氟污染土壤的修复中，比较修复效果，以探明产酸菌是否能有效促进植物对土壤氟的吸收，为氟污染土壤的绿色生态修复提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

菌株分离样品来源于工业污水处理厂厌氧池。供试植物为1年生茶梅苗（Camellia sasanqua），购自衢州市三山花卉有限公司。

盆栽试验供试土壤采集于衢州学院校园周边农田表层（0～20 cm），除杂、风干、研磨后过20 目标准筛后密封保存备用。土壤基本理化性质：土壤 pH 6.1，有机质含量14.43 g/kg，铵态氮含量86 mg/kg，有效磷含量26.36 mg/kg，速效钾含量213 mg/kg，全氟含量48.89 mg/kg。

1.2 培养基

LB培养基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨10.00 g，NaCl 5.00 g，琼脂15.00～25.00 g，水1 L，pH 7.4～7.6。

产酸菌培养基：葡萄糖20.00 g，蛋白胨5.00 g，牛肉膏3.00 g，酵母浸粉0.50 g，L-半胱氨酸0.50 g，NaCl 5.00 g，K2HPO4 0.50 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，水1 L，pH 6.5，固体培养基加1.5％的琼脂。

1.3 产酸菌的筛选分离

移取污泥悬液1 mL加至含50 mL LB培养基的150 mL锥形瓶中，于30 ℃恒温培养箱富集培养48 h，取1 mL富集培养液，用灭菌水依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。从10-4、10-5、10-6稀释液中分别移取0.1 mL接种至产酸菌固体培养基上涂布分离，再挑取单菌落进行划线分离直至得到单菌落，滴加酚红溶液观察菌落周边颜色变化，将产生变色圈的菌株接种至产酸菌液体培养基，培养24 h后测定培养液pH，根据pH判定菌株产酸能力，复筛获得产酸能力最佳菌株，甘油密封后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 菌株的生长特征及产酸能力

采用LB培养基活化优势产酸菌株，按1%接种量接种菌悬液至产酸菌液体培养基，在30 ℃、120 r/min 条件下振荡培养24 h，每隔1 h测定培养液OD600，以不接种菌悬液的产酸菌培养基为空白对照。

1.5 菌株形态学及理化鉴定

菌落的大小、颜色、形状等形态特征通过肉眼观察；菌体微观形态特征通过革兰氏法染色在光学显微镜下观察。菌株常规生理生化反应（VP试验、甲基红试验、淀粉水解试验、过氧化氢酶试验、糖发酵试验）参照伯杰氏细菌鉴定手册的常规方法进行。

1.6 16S rDNA 序列测定和同源性比较

以细菌基因组DNA为模板扩增16S rDNA，扩增采用一对通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）；PCR扩增条件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 1.5 min，72 ℃ 5 min。PCR 产物送上海生物工程有限公司完成测序，测序结果通过GenBank Blast 进行相似性分析，用Glustal W 1.8软件包中的邻接法（neighbour-joining）构建系统发育进化树。

1.7 氟污染土壤修复试验

采用盆栽试验，选用塑料小盆，每盆装土500 g，按照表1方案分别加入氟化钠溶液，加水保持60%田间持水量，平衡30 d后种植1年生茶梅苗，每盆种3株；微生物修复是在植物种植前喷洒优势产酸菌培养液，每组设3次重复。修复30 d后取土壤和植物样品测全氟含量。

1.8 样品测定

植物样品清洗后置于100 ℃恒温烘箱干燥至恒重，用粉碎机粉碎、过40目标准筛，装入密封袋中并贴上标签，置于冰箱保存备用。土壤样品除杂后置于室外阴凉通风口，经自然风干后，研磨过60目标准筛，装入密封袋中并贴上标签，置于冰箱保存备用。应用氟离子选择电极法测定土壤、植物样品全氟含量［15-16］。

1.9 数据分析

利用统计分析软件Origin 8.0 对试验数据进行分析和处理。

2 结果与分析

2.1 优势产酸菌的分离与鉴定

2.1.1 菌株筛选。

经富集、划线分离、滴加酚红变色等途径筛选分离纯化得到13株产酸细菌，按序号从Cs-1依次命名至Cs-13。将13株菌株接种至产酸菌液体培养基培养24 h后测定培养液pH，其中菌株Cs-3培养液pH最低，由初始值6.5下降至3.88，选择作为下阶段试验用菌株。

2.1.2 菌株形态与生化鉴定。

菌株Cs-3 在产酸菌固体培养基上培养24 h后，菌落呈白色圆形，不透明，表面凸起光滑，边缘整齐；经革兰氏染色后在显微镜下观察其细胞呈球形状，无芽孢，革兰氏阴性；甲基红、淀粉水解、过氧化氢酶、糖发酵试验呈阳性；荚膜、VP、明胶液化试验呈阴性。

2.1.3

菌株的16S rDNA测序结果。菌株Cs-3提交GenBank获得的登录号为MG755257，其16S rDNA序列经Blast比对分析，与GenBank中葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）的16S rDNA序列具有99%同源性，构建的系统发育进化树如图1所示。结合菌株的形态和理化特征，初步鉴定Cs-3菌株为沃式葡萄球菌（Staphylococcus warneri），命名为Staphylococcus warneri Cs-3。