羌活根际土壤微生物群落结构特征及其对次生代谢产物的影响

摘要［目的］科学评估羌活主产区土壤生态系统健康状况，揭示土壤微生物与羌活的互作关系。［方法］以羌活根际土壤为研究对象，分别采用高通量测序技术和高效液相色谱法（HPLC）测定土壤微生物群落结构组成和羌活次生代谢产物含量，进一步采用冗余分析和相关性分析方法研究根际土壤微生物对羌活次生代谢产物的影响。［结果］羌活根际土壤细菌优势门类群为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），真菌优势门类群为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和球囊菌门（Glomeromycota）。属水平上，细菌优势属为Vicinamibacter（0.80%～9.11%）、土生单胞菌属Terrimonas（0.66%～7.72%）和硝化螺旋菌属Nitrospira（1.18%～4.46%）；真菌优势属为被孢霉属Mortierella（0.01%～14.19%）、四孢菌属Tetracladium（0.18%～14.32%）和黄豆菌属Kotlabaca（0.01%～24.96%）。冗余分析表明羌活根际土壤微生物群落结构主要受土壤pH及养分含量影响，其中Colletotrichum和Botryichum与pH呈显著负相关（P<0.05），Bradyrhizobium与有机质亦呈显著负相关（P<0.05），Candidatus_Udaeobacter、Scutellospora和Enterocarpus均与速效磷和速效氮呈显著正相关（P<0.05）。羌活次生代谢产物羌活醇与毛壳菌属（Chaetomium）、丝盖伞属（Inocybe）和米拉珊瑚属（Melanophyllum）呈显著负相关（P<0.05），异欧前胡素则与毛壳菌属（Chaetomium）和腐质霉属（Humicola）呈显著正相关（P<0.05）。［结论］该研究结果为科学评估羌活主产区土壤生态系统健康状况和微生物-羌活互作关系提供数据支撑。

关键词羌活；根际土壤；微生物群落；结构特征；高通量测序；理化因子；次生代谢产物

中图分类号S 154.3文献标识码A文章编号0517-6611（2023）24-0173-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.039

Characteristics of Rhizosphere Soil Microbial Community Structure and Its Effects on Secondary Metabolites of Notopterygium incisum

WANG Honglan1， ZHU Wentao1， CUI Junfang2 et al

（1.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu，Sichuan 610041;2. Institute of Mountain Hazards and Environment， Chinese Academy of Sciences， Chengdu，Sichuan 610299）

Abstract［Objective］ To scientifically evaluate the health status of the soil ecosystem in the main production areas of N. incisum， and reveal the interaction relationship between soil microorganisms and N. incisum.［Method］Taking the rhizosphere soil of N. incisum as the research object， highthroughput sequencing technology and highperformance liquid chromatography （HPLC） were used to determine the composition of soil microbial community structure and the content of secondary metabolites of N. incisum. Furthermore， redundancy analysis and correlation analysis methods were used to study the impact of rhizosphere soil microbiota on secondary metabolites of N. incisum.［Result］The results showed that the dominant bacterial at the phylum level were Proteobacteria， Acidobacteria and Bacteroidetes， and the Ascomycota， Basidiomycota and Glomeromycota were identified as the dominant phyla of fungi. At the genus level， the dominant genera of soil bacteria were Vicinamibacter， Terrimonas and nitrospira， which accounted for 0.80%-9.11%， 0.66%-7.72% and 1.18%-4.462%， respectively. For fungi， the dominant genera were Mortierella， Tetracladium and Kotlabaca， which accounting for 0.01%-14.19%， 0.18%-14.32% and 0.01%-24.96%， respectively. Redundancy analysis showed that the microbial community structure of the rhizosphere soil of N. incisum was mainly affected by soil pH and nutrient content. Colletotrichum and Botryichum showed significant negative correlation with pH （P<0.05）， while Bradyrhizobium also showed significant negative correlation with organic matter （P<0.05）. Candidatus_ Udaeobate， Scutellospora and Enterocarpus were significantly positively correlated with available phosphorus and available nitrogen （P<0.05）.The notopterol content were significantly negatively correlated with Chaetomium， Inocybe and Melanophyllum （P<0.05）， respectively， while isoimperatorin content was significantly positively correlated with Chaetomium and Humicola （P<0.05）， respectively. ［Conclusion］The results of this study can provide data support for scientific assessment of soil ecosystem characteristics and microbialN. incisum interactions in the main N. incisum production area.

Key wordsNotopterygium incisum;Rhizosphere soil;Microbial community;Structural characteristics;Highthroughput sequencing;Physical and chemical factors;Secondary metabolites

羌活（Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang）是伞形科（Umbelliferae）羌活属（Notopterygium de Boiss.）多年生药用植物，是传统中藏羌医药体系常用大宗药材羌活（Notopterygii Rhizoma et Radix ）最重要的基源植物［1］。羌活野生资源主要分布于川、陕、甘、青、藏等地，2010年以来四川甘孜、阿坝及甘肃宕昌等地开始人工栽培。目前有关羌活的研究多集中于种子种苗繁育［2-3］、集约化栽培技术［4-6］及药材化学品质［7］等方面，对密切影响羌活药材产量和品质的根际微生态系统鲜有报道。根际是地球上物质和能量循环、信息交换最活跃的界面之一，也是植物-微生物-土壤三者相互作用密切的一个复杂的生态系统［8］。根际微生物是联系植物群落与土壤养分循环的关键纽带［9］，在向植物提供养分、增强养分的有效性、帮助植物转化吸收土壤养分等方面发挥巨大作用［10-11］。同时，根际微生物可通过多种方式促进药用植物的生长发育［12］和有效成分的合成积累［13］，对提高药用植物的抗病虫害能力［14］、缓解连作障碍［8］和拮抗病原微生物［15-16］等具有重要的作用。因此，该研究以川西北羌活产区根际土壤为研究对象，采用PacBio单分子测序技术，结合16S rDNA和ITS全长测序测定微生物群落多样性和组成结构，阐明羌活根际土壤微生物群落结构特征，并对该时期土壤微生物多样性与土壤理化因子、羌活次生代谢产物含量进行相关性及冗余分析，揭示微生物对羌活次生代谢产物的影响，为科学评估羌活主产区土壤生态系统特征和微生物-羌活互作关系提供数据支撑。

1材料与方法

1.1研究地概况

选取羌活道地产区阿坝藏族羌族自治州境内4个较早开始人工栽培羌活的代表性研究地为研究对象，分别位于马尔康市、小金县、松潘县和黑水县境内。研究地的基本概况：①马尔康样地（MEK），位于马尔康市马尔康镇纳足村（102°27′23″E，31°30′28″N），属高原亚寒带气候，海拔2 960 m，年平均气温8～9 ℃，年降水量750 mm。②小金县样地（XJ），位于小金县两河口镇大板村（102°25′22″E，31°32′48″N），属高原亚温带气候，海拔3 263 m，年平均气温10 ℃，年降水量614 mm。③松潘县样地（SP），位于松潘县岷江乡北定关村（103°43′22″E，31°21′28″N），属青藏高原季风气候，海拔2 531 m，年平均气温7～8 ℃，年降水量730 mm。④黑水县样地（HS），位于黑水县沙石多镇杨柳秋村（102°48′18″E，32°06′09″N），属季风高原型气候，海拔2 771 m，年平均气温9 ℃，年降水量620 mm。

1.2植物和根际土壤样品采集

在4个研究区域，选取地形地貌相似、栽培管理措施相近的羌活种植地块，按“S”布点方式，分别设置10 m×10 m的样地，采集羌活植株和根际土壤样本。将羌活植株连根系整体取出，轻轻抖动去除根围土壤，将根及根表附着的土壤作为根际土壤。利用无菌毛刷采集根部附着紧密的土壤，混合3个植株的根际土壤样本，作为1个根际土壤样本，以等量混合均匀地装入2 mL 冻存管；收集用于次生代谢产物含量检测的羌活地下部分；另取0～30 cm分散土样（约1 kg）用于土壤理化性质的测定。每个研究地块根际土样重复3次（MEK1、MEK2、MEK3、XJ1、XJ2、XJ3、SP1、SP2、SP3、HS1、HS2、HS3），分散土样及植物样重复9次。样品采集时间为2021年10月。

1.3样品预处理和保存

于60 ℃烘干羌活地下部分，磨成粉末状（过3号筛）后放入真空干燥箱内待用。在-80 ℃超低温冰箱中保存根际土壤样本，用于微生物多样性的检测。将土样分散自然风干，除去碎石、根系等杂物，经碾磨后过2 mm 筛测定土壤pH、全氮含量、全磷含量、全钾含量、速效氮含量、速效磷含量和速效钾含量，过0.125 mm筛后测定土壤有机质含量。

1.4根际土壤理化性质常规分析

土壤酸碱度用酸碱度测定仪（土水比1∶10）测定；土壤有机质含量按重铬酸钾氧化容量法测定；采用硫酸加速剂消解-凯氏法测定全氮含量；采用氢氧化钠熔融钼锑抗比色法测定全磷含量；全钾含量采用熔焰光度法（将氢氧化钠熔化）进行测定；采用碱解扩散法测定速效氮含量；速效磷含量的测定采用0.5 mol/L碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法；速效钾含量采用NH4OAC浸出法-火焰光度法测定。上述检测方法参考《土壤农化分析（第3版）》［17］。

1.5根际土壤微生物群落结构分析

取0.25 g土壤样品，用试剂盒（PowerSoil DNA Isolation kit）提取土壤总DNA，通过细菌16S rRNA V1～V9区全长引物27F（5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′），真菌ITS rRNA 全长引物ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）分别进行引增合成。再用电泳检测，检测后提纯，提纯后用Qubit定量PCR产物，等量混样后按PCR浓度进行高通量顺序。

对原始下机的Sub-reads进行校正得到CCS序列，通过Barcode序列识别不同样本的CCS序列并去除嵌合体，得到高质量的CCS序列，利用Cutadapt v2.7（错误率0.2）识别正向引物和反向引物，抛弃不含引物的CCS序列，过滤CCS长度，将序列聚类在相似度97%的水平上，以测序所有序列的0.005%作为阈值，过滤OTU。利用Usearch软件在97%的相似度水平上聚类Tags，获取OTU，并基于Silva（细菌）和Unite（真菌）分类数据库对OTU进行分类注释。