宏基因组在动物肠道微生物中的应用研究进展

摘要 肠道微生物与机体之间始终保持着一种动态平衡的关系，它们不仅在机体的消化吸收方面发挥作用，而且在机体免疫、营养物质代谢等方面起着重要调节作用。近年来，随着宏基因组研究的快速发展，人们利用宏基因组在动物肠道菌群上进行了广泛研究，肠道微生物菌群结构及其在生理代谢途径中发挥的作用在此基础上得到了更全面的认识。综述宏基因组在肠道微生物方面的研究进展，旨在为动物生产相关领域的研究提供参考。

关键词 宏基因组;肠道微生物;全基因组测序;16S rRNA

中图分类号 S852.6  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）01-0018-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.005

Research Progress in the Application of Metagenomics in Animal Gut Microbes

YU Huan1，2，LI Hui1，2

（1.Key Laboratory of Plateau Mountain Animal Genetics， Breeding and Propagation， Ministry of Education， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025; 2. College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025）

Abstract There is always a dynamic balance between intestinal microorganisms and the body. They not only play a role in digestion and absorption， but also play an important regulatory role in immunity， nutrient metabolism and other aspects of the body. In recent years， with the rapid development of the research on metasomes， people have conducted extensive researches on the intestinal flora of animals by using metasomes， on the basis of which the structure of intestinal microflora and the role they play in physiological metabolic pathways have been more comprehensively understood. Review the research progress of metagenomics in intestinal microorganisms， aiming to provide reference for the research in the field of animal production.

Key words Metagenomics;Intestinal microorganisms;Whole genome sequencing;16S rRNA

基金项目 贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑〔2019〕2285号）;贵州省地方家禽产业联合攻关项目（黔财农〔2020〕175号）。

作者简介 余欢（1996—），女，四川自贡人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种与繁殖。

通信作者，教授，博士，从事种质资源保护与利用研究。

收稿日期 2021-04-11

微生物广泛存在于自然界中，肠道微生物在动物机体整个生长发育过程中发挥着重要作用，其最重要的代谢功能就是对动物自身不能利用的碳水化合物进行酵解，提高养分的利用率，从而满足机体的生长及繁殖。机体对难以消化的糖类如麦芽糊精等的利用就是通过肠道微生物的作用实现的[1]。除此之外，肠道内的微生物菌群在机体的生理、免疫和营养状况等方面也发挥着作用[2]。相较于传统的微生物分离培养技术，用宏基因组学技术研究肠道微生物，不仅大大提升了人们对肠道微生物的了解，而且能够更快速、客观、全面地检测菌群种类与结构组成。因而，越来越多的学者采用宏基因组的方法进行肠道微生物的研究。

肠道微生物有着数目庞大、种群繁多、分类复杂的显著特点。采用宏基因组的手段对肠道微生物进行研究能够更全面地认识动物微生物群的种类和结构功能，探索饲粮的变化与动物肠道微生物之间的关系，能够更客观全面地认识动物的消化机理，在预防与治疗肠道疾病或者与微生物菌群变化有关的疾病时提供相应的理论支持等。

1 宏基因组的概念

宏基因组学（metagenomics）是以特定环境里包含的所有微生物的基因为研究对象，把微生物菌群的数量结构及功能和外部环境存在的关系作为研究目的的一种微生物研究手段。Handelsman等[3]在1998年把宏基因组解释为：环境中一切微生物的总和，包括特定环境中可培养与不可培养的所有微生物基因，主要为特定环境中真菌和细菌基因组的总和。

2 宏基因组技术

宏基因组技术流程主要有4个步骤：①特定环境中样品基因的富集处理;②提取样品中的DNA;③宏基因组文库的构建与筛选;④目的克隆基因的检测。其中宏基因组文库的构建与筛选是技术流程的关键点。宏基因组文库的构建就是在分子克隆原理和技术的基础上，通过原位裂解法或异位裂解法尽可能多地提取出样品中全部的DNA，为了获得完整的目的基因或者基因簇，在对样品DNA进行提取时保持较大片段的完整性[4]。文库的筛选包括：①基于功能筛选，就是根据克隆产生的新生物，对其进行活性的筛选。Tyson等[5]在研究小鼠的肠道微生物时筛选出了一种新的非培养微生物基因，基于此试验，β-葡聚糖酶的活性克隆被发现。②基于序列筛选，是对已知功能的基因进行探针设计或者PCR引物设计，然后对该基因进行杂交或者PCR扩增筛选阳性克隆。③化合物结构筛选，是在宿主细胞进行转入以及未转入外源基因或发酵液、提取液的色谱图比较的基础上进行筛选。④底物诱导基因表达筛选，是在底物诱导克隆子分解代谢基因的基础上进行筛选[6]。

3 宏基因组测序方法

宏基因组样本测序方法包括全基因组测序（de novo 测序）和扩增子测序，其中全基因组测序是基于由高通量测序技术提取环境样品微生物DNA片段的序列信息，从而评估肠道菌群的组成以及功能[7]，主要用于基因识别、基因代谢通路分析、环境分类分析等[8]，它在研究微生物分子进化、基因组成、基因调控等方面有着重要意义。扩增子测序或称标签序列，是对一些在进化中有着高保守、短序列的基因序列进行微生物群落多样性的系统发育关系等方面的分析[9]。扩增子测序主要采用的是16S rRNA基因序列[10]，选择16S rRNA 一方面因为它在细菌RNA中占比80%以上，另一方面因为与16S rRNA相比，5S rRNA有较短的序列，23S rRNA 有较快的碱基突变率，其中18S rRNA是16S rRNA在真核生物中的同源体。

4 肠道微生物的功能

肠道微生物中的细菌数量超过99%，严格厌氧菌高达97%，只有3%是需氧菌。肠道微生物参与维持胃肠道微生态动态平衡，调节宿主的能量储存与代谢[11]，激活肠道免疫系统与机体相互作用[12]，参与多个代谢途径的调控，它们不仅在消化、免疫、机体发育等方面起着重要作用，而且在肠道功能和屏障完整性的维持以及繁殖性状的表现等方面发挥着相应功能[13]，因而被称为动物的“第二基因组”。

肠道微生物在不同个体之间的群落组成不同，即使是同一个体，不同部位的组成也略有差异。饮食、环境、年龄、遗传等因素都对肠道微生物群落结构有着或多或少的影响。研究发现，人类肠道微生物菌群结构与饮食习惯有很大关系，饮食以碳水化合物为主发现含有较多的普氏杆菌属，而以高蛋白、高脂肪食物为主发现以拟杆菌属为主[14-15]。机体通过自身的适应性应答或疾病等方式对环境的改变做出回应，与此同时，肠道内的微生物菌群也会做出相应的变化，用以完成机体对环境的适应性调节[16]。研究表明，随着年龄的增长，肠道微生物的变化呈现出一定的规律，比如厌氧菌含量呈现出一定量的增加，而双歧杆菌、乳杆菌和拟杆菌等含量相对减少[17-18]。由肠道微生物产生的短链脂肪酸（SCFAs）参与着机体的免疫调节和自身免疫炎症过程[19]，其途径主要是激活G蛋白偶联受体以及抑制组蛋白去乙酰化酶[20];SCFAs通过为肠黏膜细胞提供能量，促进细胞的生长以及代谢，通过降低肠道内环境的pH来减少有害菌，从而维持肠道功能的稳定[21-22]。胆汁酸可以促进肠道对脂质和维生素的消化吸收，在机体免疫方面发挥作用，肠道微生物可以促进初级胆汁酸转变为次级胆汁酸，进而对体内胆汁酸含量进行调控[23]。

近年来，肠道微生物与一些常见疾病之间的研究也在进行中。研究发现，肠道菌群结构紊乱与儿童孤独症有关[24];帕金森病的发病[25]伴随着肠道微生物群失调;肠道微生物的变化可以IBD的治疗起到反馈作用[26];肠道微生物还与肥胖的治疗、Ⅱ型糖尿病的治疗、癌症的治疗等有着重要关系[27-29]。这些研究表明，肠道微生物菌群的数量与结构对诊断和治疗疾病有重要作用。

肠道微生物在肠道甚至整个机体上都起着重要作用，因而了解其群落构成以及功能显得尤为重要。早期研究肠道微生物的方法是微生物培养，传统研究是对其进行体外培养，然后对其结构和功能进行研究。然而，只有1%的微生物能够进行常规分离培养，局限性非常大，能够进行体外培养的微生物只占微生物总量的很少一部分。在宏基因组手段的帮助下，避开了对微生物菌种进行纯培养的障碍，直接从自然界获取遗传信息、活性物质和功能基因，技术上比用纯分离培养法有了很大的进步，大大缩短了时间，能够更清晰地认识微生物的结构和功能，拓宽了微生物资源的利用空间。

在肠道微生物基因集构建方面，从2010年起人、鼠和猪的肠道微生物参考基因集就已经被构建出来[30-33]。近年关于鸡的肠道微生物基因集构建有了重大进展，张艳[34]获得了鸡的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结直肠等的首个肠道微生物宏基因集，并对相关基因序列进行了功能注释。王恒超[35]构建了第一个完善的鸡肠道微生物的基因集。人类及部分动物的肠道微生物基因集的构建，能够帮助人们定位微生物、监测人类及动物的健康状态，在疾病的治疗方面也可以发挥重要作用。

5 宏基因组在动物肠道微生物的应用研究

动物的品种、生长阶段、饲料、肠道段落等与肠道微生物多样性的变化都有关联。Yang 等[36]研究发现，动物品种与肠道微生物区系组成有关，不同猪种的肠道微生物组成也不相同。Kim等[37]研究发现，动物不同生长阶段的肠道微生物组成也各不相同。张辉等[38]通过对不同处理组中梅花鹿的瘤胃液样品进行宏基因组测序，结果显示，饲喂粗纤维较多的玉米秸叶，优势菌群为能降解纤维的瘤胃球菌属和纤维杆菌属;饲喂含碳水化合物较多的柞树叶时，普雷沃菌属等为优势菌群，表明饲喂柞树叶更能促进新陈代谢，更适合东北梅花鹿营养需求以及瘤胃微生物的繁殖和生长。温康等[39]通过对朗德鹅的肠道微生物进行16S rRNA测序，发现填饲组朗德鹅的空肠和回肠中的厚壁菌门以及放线菌门的相对丰度明显增加，其中放线菌门数量的增加可能和鹅肥肝不发生病变有关系。Danzeisen等[40]研究发现，在日粮中添加莫能霉素可减少鸡回肠中氏菌属（Roseburia）、乳酸菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus），增加粪球菌属（Coprococcus）、还原菌属（Anaerofilum）以及硫酸盐，在同时添加威里霉素或泰乐菌素的对照组中，出现大量埃希氏菌属（Escherichia coil）。谭振[41]证实在饲料效率存在差异的情况下，相同猪种的粪便及肠道各段微生物之间存在差异，回肠中的优势菌属是厌氧杆菌属（Anaerobacter）和Turicibacter，而在结肠中普氏菌属（Prevotalla）、颤杆菌克（Oscillibacter）和琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）则相对更加富集，表明高低饲料效率组在盲肠位置上差异的通路主要与丙酮酸相关代谢途径有关，结肠微生物差异与多个参与到辅酶因子和维生素代谢有关。