沙门氏菌分析检测方法研究进展

摘要 沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，可引发多种人畜共患病。在世界各国的细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌造成的中毒病例常居首位，严重威胁着人畜的生命健康。对食品中的沙门氏菌进行准确、快速的分析检测可预防该致病菌引发的食源性疾病，对于保障人畜的饮食安全具有重要意义。综述了检测沙门氏菌的几种典型分析方法及其优缺点，并对沙门氏菌检测技术的发展进行了展望。

关键词 沙门氏菌;食品安全;检测方法;研究进展

中图分类号 TS207.4文献标识码 A文章编号 0517-6611（2022）02-0005-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.002

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research Progress in Analysis and Detection Methods for Salmonella

LI Ao，JIA Bo，LIU Feng et al

（Xiangyang Public Inspection and Testing Center， Xiangyang， Hubei 441104）

Abstract Salmonella is a common food-borne pathogen that can cause a variety of zoonotic diseases. Among the bacterial food poisoning incidents in various countries in the world， the poisoning cases caused by Salmonella are often the first， which seriously threatens the lives and health of both humans and animals. Accurate and rapid analysis and detection of Salmonella in food can prevent food-borne diseases caused by the pathogenic bacteria， which is of great significance for ensuring the safety of human and animal diets. This paper reviews several typical analytical methods for the detection of Salmonella with their advantages and disadvantages， and prospects for the development of Salmonella detection technology.

Key words Salmonella;Food safety;Detection methods;Research progress

作者简介 李傲（1993—），男，湖北襄阳人，硕士，从事食品安全检测研究。*通信作者，副主任药师，从事食品药品质量控制及基础研究。

收稿日期 2021-05-16;修回日期 2021-06-16

沙门氏菌属肠杆菌科，是革兰氏阴性肠道杆菌，最早于1885年被美国细菌学家 Salmon和Smith从霍乱中分离并发现[1]，目前已发现近3 000种血清型[2]。沙门氏菌的生存能力较强，对营养条件要求较低，在肉、蛋、奶、面包等各类食品和土壤、粪便等基质中可存活5个月至2年，因其在污染食品后不会出现明显的感官性状变化，因而极易被人类和畜禽误食并引发食源性疾病[3]，如人类胃肠炎、败血症、类伤寒等感染型食物中毒，以及鸡白痢、猪霍乱、禽伤寒等动物性疾病。近年来，沙门氏菌引发的食品安全事件在世界范围内频繁发生。通常，正常人体摄入沙门氏菌食用量超过105 CFU即可造成感染，而免疫功能低下或高度易感人群摄入15～20 CFU即可引起沙门氏菌感染[4]。人体在感染沙门氏菌后，初期症状表现为发烧、腹泻、恶心、呕吐等，若不及时进行治疗则会导致病情持续恶化，最终死亡率可达10%[5-6]，因此，沙门氏菌是食源性致病菌的重点监控对象，对其进行准确、快速地检测，是预防和控制由于沙门氏菌感染而导致的食源性疾病的有效手段。目前，沙门氏菌的检测方法主要有传统的平板培养和生化鉴定法、免疫学检测方法、分子生物学检测方法，以及近年来开发出的各种新型检测技术，如基于适配体的生物传感器技术、微流控技术、量子点技术等，这些方法为沙门氏菌的精准化检测提供了更多选择，也为其进行即时检测启迪了新的思路。

1 传统标准检测法

目前国际和国内用于检测食品中沙门氏菌的主要标准方法有国际标准 ISO 6579：2002《食品和动物饲料的微生物学 沙门氏菌水平位置的检测法》[7]和《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4-2016）[8]。这2种标准方法都是基于沙门氏菌的生长及生化特性，检测过程具体可分为5个步骤，即18～24 h前增菌、24 h选择性增菌、48 h分离培养、生化鉴定以及血清分型等，检测时长4～7 d，操作过程烦琐，结果判定迟缓，且由于肠杆菌科细菌间的生化反应多有交叉，因而在快速、灵敏与特异性等方面有所不足。近年来，有学者在传统检测方法的基础上尝试进行了改进工作，如用疏水网膜法（HGMF）[9]提高菌体富集效率;或用添加物质法[10]和显色培养基法[11]提高菌体的分离与鉴定效率。这些改进方法在不同程度上缩短了检测时长或降低了检测限，但仍未从根本上改变传统生化鉴定法耗时费力、效率低下的现状，因此有待开发更加快速、简便的检测方法。

2 基于免疫学的检测方法

基于免疫学的检测方法检测致病菌的原理是以菌体表面抗原和其对应的单抗或多抗间的特异性结合反应为基础，再辅以其他结果输出手段加以鉴定。由于免疫学的方法具有特异性较强、灵敏度较高的特点，靶标菌可在较短的时间内被检出，因此在食品微生物检测中的应用相对广泛。目前已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法主要分为酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫荧光法、免疫磁珠分离技术、以同位素标记抗体（放射免疫试验）为基础的方法，以及其他多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散、免疫印迹及免疫色谱技术等的方法[12]，其中，以前3种的应用更为常见。

2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附测定法（ELISA）用于检测食品中沙门氏菌的历史最早可追溯至1977年[13]，该法至今仍被广泛用于食源性致病菌的检测。以双抗体夹心法为例，其基本原理大致如下：抗体预先结合在载体表面，然后依次加入受检样品和酶标抗体使其与载体上的抗体发生反应形成“固定化抗体-靶标抗原-酶标抗体”复合物，洗涤后加入酶反应底物，底物被复合物上的酶催化变为有色产物，最后通过定量分析有色产物即可确定样品中待测物的含量[14]。伍燕华等[15]以抗沙门氏菌多克隆抗体和抗沙门氏菌单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，建立了快速检测沙门氏菌的双抗夹心ELISA法，该法可以同时检测 A、B、C、D、E等多种类型沙门氏菌。此外，间接ELISA也常被应用于实际检测当中，有学者用该法分别成功检测了鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌[16-17]。通常，常规ELISA 法的检测限大致为104 ～105 CFU/mL，检时长约为48 h[18]，检测效率和检测通量相对于传统检测法有明显提高，但仍然耗时费力，无法避免检测前的长时间增菌过程，且在实际操作中如果洗板不彻底则易出现假阳性结果，洗板过度容易造成假阴性结果，因此对试验人员的操作技巧要求较高。

2.2 免疫荧光法

免疫荧光检测是一种结合了荧光标记技术的免疫学检测方法，用该法检测沙门氏菌的具体操作是先用荧光素标记抗沙门氏菌抗体制成荧光标记物，再以其作为分子探针检查样品中的沙门氏菌，最后在荧光显微镜下观察样品，并根据实际荧光情况定位和定量靶标菌[11]。研究发现，用免疫荧光法检测样品中的沙门氏菌，结果可以检测玻片样品120个/h，与传统检测法相比，准确率高达96%;用该法检测沙门氏菌，可同时进行14个样品的检测工作，结果准确度高[19]。还有学者利用表面吸附的原理将检测样品吸附于一种薄膜上，然后在荧光显微镜下观察结果，检测限可达103～105 CFU/mL[20]。Pandey等[21]开发了一种夹心免疫荧光分析法用以检测伤寒沙门氏菌，该法以多黏菌素B和抗Vi抗体分别作为黏结剂和捕集剂，以碱性磷酸酶和对硝基苯酚磷酸盐分别为标记物和显色底物，最终的检测限达10 CFU/mL。总之，这种检测方法检测速度快、灵敏性高、特异性较强，但是也不排除可能存在的非特异性染色、结果判定主观性较强等问题。

2.3 免疫磁珠分离检测

免疫磁珠分离技术就是将特异性抗体偶联至磁珠表面制得免疫磁珠，该磁珠可以在短时间内快速选择性地捕获液态食品中可能存在的少量靶标物（如致病微生物等），然后在外加磁场如磁力架的作用下，免疫磁珠带动靶标物定向移动，进而从食品基质中实现对靶标物的分离与富集，再结合其他快速检测技术作为信号输出手段，即可在几小时内完成检测全过程。该法检测效率高、适用范围广，因而在食源性致病菌检测中得到广泛的应用[22]。Skjerve等[23]用此法实现了每1 g原始样品中10～20个沙门氏菌的分离效率，并在蔬菜和肉类食品中分离出靶标菌，检测限达100 CFU/g。近年来，李亚茹等[24]用免疫磁珠分离技术结合实时荧光PCR技术在6 h内对虾中4种不同的沙门氏菌实现了快速检测，并在40份实际样品的检测中获得了与国际检测法一致的结果。Mansfield等[25]曾比较过免疫磁珠分离技术和常规方法分别对沙门氏菌从食品基质中的分离效果，他们对生鸡肉等120种食物样品进行了测试，结果表明，免疫磁珠分离技术和标准富集方法的分离效果基本一致，不过前者在检测时长方面占据绝对优势。免疫磁珠分离技术能捕获因受损伤而不具备增殖能力的靶细菌，而目前所用的几种常规方法则不具备这样的能力。

3 基于分子生物学的检测方法

近年来，以分子生物学技术为基础的分析检测方法发展迅速，其基本原理是通过检测特定核酸序列的特异性来分离鉴定不同种类或不同生理状态的微生物[26]。常用的分子生物学检测技术包括聚合酶链式反应（PCR）技术、环介导等温扩增（LAMP）技术、基因芯片（gene chip）技术等[27]，这些方法以其灵敏、特异、快速的优点而逐步应用于食源性致病菌的鉴定和检测。

3.1 聚合酶链式反应（PCR）技术

PCR检测法与传统的检测方法相比，具有特异性强、灵敏度和自动化程度都较高的优点，在生物检测领域中通常作为一种信号放大手段，尤其适合微量抗原的检测。Delibato等[28]用实时荧光定量PCR 法检测猪肉样品中的沙门氏菌，检测限低至10 CFU/25g，并且结果表明，该法与ISO 6579：2002标准方法展现出了较好的一致性。Alves等[29]首次运用了一种包含内部放大控制（internal amplification control，IAC）机制的多重实时荧光定量 PCR法（multiplex real-time PCR）来同时检测鸡肉样品中的沙门氏菌和弯曲杆菌，未经富集培养和经过24 h富集培养得到的沙门氏菌检测限分别为106和 1 CFU/mL，实现了快速同时检测样品中沙门氏菌等致病菌的目标，其中 IAC的使用可以有效规避假阴性问题，提高检测的准确性。王青龙等[30] 通过实时荧光PCR法快速准确地检测出亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌，灵敏度可达1～10 CFU/mL，程玲玲等[31] 建立了一种无须核酸提取的直接PCR法检测鸡白痢沙门氏菌，检测限不超过103 CFU/mL。总之，PCR法具有较好的灵敏性，然而在样品实际检测的各环节中由于对引物设计有时要求较高，实验操作需相对精细，因此结果的重复性偶尔较差。