反相高效液相色谱法测定枯草菌肽的含量及纯度

摘要 [目的]建立枯草菌肽含量及纯度的反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测方法。[方法]采用ZORBAX 300SB-C 8（4.6 mm×150 mm，5 μm），以三氟乙酸-水（1∶1 000）为流动相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）为流动相B;柱温25 ℃，检测波长280 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，线性梯度洗脱。[结果]在室温条件下，枯草菌肽溶液12 h内稳定，RSD为0.61%;枯草菌肽主峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.18%和0.22%，不同实验员间的 RSD为0.92%;枯草菌肽的定量限（LOQ）为120 ng、检出限（LOD）为80 ng，在0.031 25～2.000 00 mg/mL线性关系良好（R2=1）;平均回收率为101.49%（n=9），RSD为0.29%;改变柱温、流速和色谱柱批号，枯草菌肽理论塔板数均大于2 000，分离度均大于1.5，相对保留时间（RRT）偏差绝对值均不大于20%。测定3批枯草菌肽含量分别为98.8%、99.8% 和 100.2%;纯度均大于99%。[结论]该研究建立的检测方法灵敏、准确、专属性强，符合定量检测枯草菌肽含量和纯度的要求，适用于枯草菌肽的质量控制。

关键词 枯草菌肽;反相高效液相色谱法;含量;纯度;定量检测

中图分类号 R 927.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）02-0206-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.056

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of the Content and Purity of Sublancin by Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography

YANG Cai-xia1，2，WU Jin-mei3，HE Tao1，2 （1.Sinagri Yingtai Linzhou Biotechnology Park Co.，Ltd.，Anyang，Henan 456550;2.Beijing Sinagri Yingtai Biological Technology Institute Co.，Ltd.，Beijing 100193;3.Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract [Objective] To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） method for detecting the content and purity of sublancin.[Method]Chromatography was performed on ZORBAX 300SB-C 8 chormagraphic column （4.6 mm×150 mm，5 μm），using trifluoroacetic acid-water （1∶1 000） as mobile phase A，using trifluoroacetic acid-water-acetonitrile （0.85∶200∶800）as mobile phase B;the column temperature was 25 ℃，the detection wavelength was 280 nm，the flow rate was 1.0 mL/min，the injection volume was 20 μL，linear gradient elution.[Result]At room temperature，the sublancin solution was stable within 12 hours，and the RSD was 0.61%.The RSD of the main peak retention time and peak area of subtilisin were 0.18% and 0.22%，respectively，and the RSD between different experimenters was 0.92%.The limit of quantification （LOQ） of sublancin was 120 ng，the limit of detection （LOD） was 80 ng，and the linear relationship was good between 0.031 25 and 2.000 00 mg/mL （R2=1）.The average recovery rate was 101.49% （n=9），and the RSD was 0.29%.Changed the column temperature，flow rate and chromatographic column batch number，the theoretical plate numbers of sublancin were all greater than 2 000，the degree of separation was greater than 1.5，and the absolute deviation of the relative retention time （RRT） was less than 20%.The content of three batches of sublancin were 98.8%，99.8% and 100.2%，respectively，with purity greater than 99%.[Conclusion]The detection method established in this study is sensitive，accurate and highly specific，which meets the requirements for quantitative detection of sublancin content and purity，and is suitable for quality control of sublancin.

Key words Sublancin;RP-HPLC;Content;Purity;Quantitative detection

作者简介 杨彩霞（1987—），女，河南商丘人，兽医师，硕士，从事新兽药研发与注册申报工作。

收稿日期 2021-05-26

在畜禽生产中，抗生素被广泛用作疾病的预防、治疗和促进生长[1]。但随着抗生素的大量使用甚至滥用，耐药性和药物残留问题日益严峻[2]，不仅导致生产动物的抗感染治疗难度加大，而且导致其免疫力低下，由此引起生产动物的疫病发病率高，死亡率高。因此，开发抗生素替代产品，尤其是增强生产动物免疫力的药物，用于畜牧养殖业是亟需解决的任务[3]。

枯草菌肽是由枯草芽孢杆菌产生的含有37个氨基酸的生物多肽，其理化性质极其稳定[4-5]，具有改善动物肠道健康、提高机体免疫力和生长性能的功能[1，3，6-12]，在畜牧行业上有着巨大的应用前景。目前，在国内外，中农颖泰林州生物科园有限公司是唯一一家实现枯草菌肽产业化生产的单位，为了更好地对枯草菌肽相关产品进行质量控制，通过查阅相关文献[4，13-14]及大量试验，该研究建立了枯草菌肽的反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测方法，可快速准确地检测枯草菌肽的含量及纯度。

1 材料与方法

1.1 材料

高效液相色谱仪（Agilent1260），购自安捷伦科技（中国）有限公司;色谱柱（ZORBAX 300SB-C 8，4.6 mm×150 mm，5 μm），购自安捷伦科技（中国）有限公司;乙腈（色谱级）、三氟乙酸（色谱级）、盐酸、氢氧化钠、过氧化氢均购自国药集团;枯草菌肽对照品（批号20141001，以干燥品计算，含量97.63%），由中农颖泰林州生物科园有限公司提供;枯草菌肽冻干粉原料3批（批号2016111601、2016112101、2016112601），由中农颖泰林州生物科园有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制。

1.2.1.1 供试品溶液。精密称量枯草菌肽冻干粉适量，用超纯水溶解稀释，再转移至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，即得。

1.2.1.2 对照品溶液。

精密称量枯草菌肽对照品10.24 mg（相当于枯草菌肽10.00 mg），用超纯水溶解稀释，再转移至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，即得1 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 枯草菌肽含量检测方法的建立。

1.2.2.1 色谱条件。用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以三氟乙酸-水（1∶1 000）为流动相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）为流动相B;柱温25 ℃，检测波长280 nm，流速1.0mL/min，进样量20 μL，按表1进行梯度洗脱。理论板数按枯草菌肽峰计算不低于2 000。

1.2.2.2 系统适用性试验。取“1.2.1.2”对照品溶液作为系统适用性溶液，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，对应理论板数、分离度、拖尾因子和峰面积4个参数分别连续进样5次。

1.2.2.3 方法专属性。考察枯草菌肽经过酸破坏、碱破坏、氧化破坏和热破坏处理后，主要破坏产物与枯草菌肽主峰的分离度，处理情况如下：①对照品，取“1.2.1.2”对照品溶液;②酸破坏，在对照品溶液中按1∶1比例加入0.1 mol/mL的盐酸溶液，室温酸破坏1 h; ③碱破坏，在对照品溶液中按1∶1比例加入0.05 mol/mL的氢氧化钠溶液，室温碱破坏15 min;④氧化破坏，在对照品溶液中按1∶1比例加入20%的过氧化氢溶液，室温氧化破坏1 h;⑤热破坏，取1 mL对照品溶液，水浴80 ℃加热15 min。

1.2.2.4 样品稳定性试验。

取供试品溶液，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h 取样，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，

计算枯草菌肽主峰峰面积的RSD，考察枯草菌肽溶液在室温12 h内的降解情况。

1.2.2.5 方法学考察。

（1）灵敏度。采用逐步稀释的方法，按信噪比S/N≥3和S/N≥10计算检出限和定量限。

（2）重复性。取供试品，按“1.2.1.1”方法制备样品6份，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，计算枯草菌肽主峰保留时间和峰面积的RSD，考察重复性。

（3）中间精密度。取供试品，按“1.2.1.1”方法分2个实验员每人制备样品6份，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，计算枯草菌肽峰面积的RSD，考察中间精密度。

（4）准确度。按“1.2.1.2”方法配制0.8、1.0、1.2 mg/mL 3个不同浓度的对照品溶液作为准确度溶液，每个浓度的准确度溶液配制3份，每份样品测定2次，共测定18次，通过计算回收率考察准确度。

（5）线性关系。将枯草菌肽对照品制备成不同浓度的工作溶液，浓度分别为2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，记录色谱图。以浓度为横坐标、主峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程及相关系数。

（6）耐用性。取“1.2.1.2”对照品溶液作为耐用性溶液，改变柱温、流速和色谱柱批号，按“1.2.2.1”项下梯度洗脱程序进行检测，记录枯草菌肽理论塔板数、分离度大于1.5和相对保留时间（RRT）偏差绝对值，考察耐用性。

1.2.2.6 含量测定。取3批枯草菌肽冻干粉，按“1.2.1.1”方法制备样品，质量浓度为1 mg/mL，每批2份，取“1.2.1.2”对照品溶液作为对照溶液，按“1.2.2.1”色谱条件进行测定，记录色谱图，采用外标法[15]，以峰面积计算各样品的含量。