冻融过程诱导精子凋亡及抗冻保护剂的研究进展

摘要 精子凋亡广泛存在于精液冻融过程，冷应激或氧化应激刺激及获能样变化均可引起精子凋亡。产生凋亡样变化的精子其结构、线粒体功能、膜电位、DNA完整性和参与凋亡反应的蛋白均发生变化，导致精子死亡率升高，活率下降。简述了冻融过程中精子凋亡的成因及抗冻保护剂的研究进展，以期为进一步提高冻融后的精子质量提供理论参考。

关键词 精子;冻融过程;凋亡;抗冻保护剂;研究进展

中图分类号 S 814  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）03-0019-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.005

Research Progress on Sperm Apoptosis Induced by Freezing and Thawing Process and Cryoprotectants

GENG Xin1，GUO Yong1，CHEN Yu2 et al

（1.School of Animal Science and Technology， Beijing Agricultural College， Beijing 102206;2.Beijing Animal Husbandry Station， Beijing 100107）

Abstract Sperm apoptosis is widespread in the process of semen freezing and thawing.Cold stress or oxidative stress stimulation and capacitation-like changes can cause sperm apoptosis.The sperm with apoptosis-like changes changes in its structure，mitochondrial function，membrane potential，DNA integrity，and proteins involved in the apoptotic response，resulting in increased sperm mortality and decreased sperm viability.This paper briefly describes the causes of sperm apoptosis during freezing and thawing and the research progress of cryoprotectants，in order to provides a theoretical reference for further improving the quality of sperm after freezing and thawing.

Key words Sperm;Freeze-thaw process;Apoptosis;Antifreeze protectant;Research progress

基金项目 现代农业产业技术体系北京市家禽创新团队项目（BAIC04-2020）;“十三五”国家重点研发计划（2016YFD0700201）;2020年农业科技项目-科技创新服务能力建设-农业科技新星计划项目（20200210）;北京市农委“菜篮子”新型生产经营主体科技能力提升工程（2018） 。

作者简介 耿欣（1997—），女，北京人，硕士，从事家禽营养调控与繁殖研究。通信作者，副教授，博士，从事家禽营养调控与繁殖研究。

收稿日期 2021-01-22

精子冷冻保存有助于动物种质资源的运输和储存，以用于人工授精和其他先进的辅助生殖技术，为保种育种工作提供便捷，还可降低畜牧场生产成本。目前，冷冻保存技术在猪和牛等哺乳动物上比较成熟。由于冻融过程会造成精子结构和代谢发生变化，导致精子利用率显著降低。冷冻-解冻过程会导致精子膜破裂或褶皱、顶体暴露或脱落以及线粒体发生肿胀[1]，超低温保存还会降低精子膜的流动性[2]，而添加抗冻保护剂可以有效改善精子损伤。此外，细胞凋亡也发生于精子冻融过程中，凋亡精子常常伴随着顶体损伤、中段缺陷和产生细胞质滴等结构变化，并与线粒体代谢之间存在显著相关性，同时凋亡的产生也会直接影响冻融后精子参数以及受精率[3]。因此，研究精子冻融过程中凋亡的分子机制，开发新型抗冻保护剂具有重要的理论和实践意义。

1 冷冻-解冻诱导的精子凋亡

1.1 冻融过程中线粒体的损伤

线粒体作为细胞凋亡的内源途径级联中心，直接参与精子在冻融过程中受到的损伤。精子线粒体与体细胞线粒体结构一致，仅数量相对较少。在精子发生过程中，线粒体随细胞质的流失而减少，剩余22～75条线粒体集中在精子中段[4]。精子冷冻-解冻过程会严重破坏线粒体结构，研究表明，精子在冻融后含有完整线粒体膜电位的活精子数显著降低[5]。线粒体膜电位的完整性直接影响线粒体功能，膜电位的变化也是细胞凋亡级联反应的起始步骤。在Bcl-2家族蛋白的作用下，线粒体通透性转换孔打开，使得凋亡因子释放到胞质中触发凋亡级联反应。体外添加线粒体通透性转换孔抑制剂可显著降低解冻后精子caspases活性，提高解冻精子线粒体膜电位，提示抑制线粒体通透性转换孔可有效减少精子超低温保存过程中的“凋亡样”变化[6]。冻融过程还可引起精子线粒体膜破裂，从而释放细胞色素C，其与凋亡蛋白酶激活因子结合并活化caspases蛋白，最终致使染色质凝聚与核破裂[7]。此外，精子低温保存引起的质膜损伤还与细胞内Ca2+浓度升高有关，低温引起线粒体大量摄取Ca2+，线粒体Ca2+含量增加引起线粒体膜通透性增加，导致线粒体基质肿胀，外膜破裂，促凋亡因子释放，最终导致细胞凋亡[8]。线粒体是产生活性氧（ROS）的主要细胞器之一，ROS在一定程度上可以调节精子获能和顶体反应，但过量的ROS会导致精子存活率、运动性、线粒体膜电位降低，以及DNA损伤、形态学缺陷和脂质过氧化的增加，加速精子的凋亡[9]。由此可见，线粒体损伤是导致精子凋亡的重要因素，保护线粒体结构的完整性是防止精子凋亡的重要途径。

1.2 冻融过程中凋亡标记的产生

冻融过程凋亡标记物呈上升趋势，包括caspase活性升高，磷脂酰丝氨酸（PS）向膜外转移，线粒体膜电位的降低（早期标记）和DNA损伤（晚期标记）[10]。在冷冻-解冻后PS外化精子的百分比增加，导致精子中大部分坏死细胞解体[11]， PS外化还可受细胞色素C的介导[12]。研究表明，导致精子DNA断裂的主要途径是凋亡过程，故DNA断裂也可作为精子凋亡的晚期标志，但目前精子DNA断裂的作用机制有待阐明。此外，精子冻融过程会使精子产生获能反应，进而导致精子凋亡。精子质膜会产生获能样改变以及蛋白质酪氨酸磷酸化，该变化在精子冻融后尤为明显[13]。在冻融过程中精子可能通过cAMP-PKA途径进行酪氨酸磷酸化（获能标记），同时也解释了冻融获能可能会导致细胞凋亡[14]。凋亡标记的发现为改善冻融后的精液品质提供了新思路。

1.3 冻融过程中凋亡蛋白的作用

1.3.1 caspases蛋白的作用。

精子中caspases的存在是细胞凋亡的重要标志之一，同时也是调控细胞凋亡的关键蛋白。研究显示，caspases蛋白家族中共9种蛋白参与细胞凋亡，根据其结构功能的不同可分为“启动子”（caspases-2、caspases-8、caspases-9、caspases-10、caspases-12）和“效应子”（caspases-3、caspases-6、caspases-7、caspases-14）[15]。在死亡受体激活的生物反应下诱导启动子自激活，继而通过蛋白质分解或次级信使机制直接或间接激活下游caspases（效应caspases）。当启动子caspases激活时，同时激活效应子裂解细胞内的蛋白质和DNA完成细胞凋亡程序[16]。在成熟精子中caspases主要集中在顶体管和细胞核周围，caspase-3、caspase-8的表达相对较高，caspase-3是最为关键的效应子[17]。人精子冻融后可检测出caspase-3前体及其活性亚基、caspase-8的前体和活化酶、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前体、活性酶和35 kDa信号[18]。精子冻融过程中的过度氧化应激也会触发凋亡，使得精子中caspase-3蛋白的表达量显著升高[19]。同时caspases还是凋亡小体的组成成分，且凋亡小体的数量与caspase-3活性呈正相关[20]。精液平衡3 h后即可表现出caspase活性[21]，冷冻解冻后，较高比例的精子显示出caspase活性，caspases阳性的活精子占30.2%～70.7%，死精子占7.3%～24.0%，且具有caspases蛋白活性的活精子与线粒体膜电位呈负相关[22]。有研究表明，冻融过程中的caspase-3活化和DNA断裂最终导致了精子细胞的凋亡[23]。通过抑制调控精子凋亡的核心蛋白酶caspase，可显著降低获能精子和磷酸化精子数[24]。caspases抑制剂处理可提高精子活力和线粒体膜电位，减少精子DNA断裂[6]。caspases依赖的凋亡机制可能起源于细胞质液滴或线粒体内，并在细胞核发挥作用。caspases的存在还可能增加PS易位和DNA断裂[25]。caspase依赖和独立的凋亡机制在精子中的作用需要进一步分析，了解这些机制可能为操纵精子凋亡以提高冻融后精子质量提供新的思路。

1.3.2 Bcl-2家族蛋白的作用。Bcl-2调控精子凋亡主要作用于线粒体，该家族蛋白至少包括18个成员，但目前在精子凋亡中可能直接发挥作用的包括促凋亡蛋白Bid、Bak和Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2，各蛋白之间可相互作用调节细胞凋亡过程。Bid从外源性死亡受体途径接收凋亡信号，并通过其切割产物截短Bid（tBid）将其传递到线粒体激活内源凋亡途径。Bax和Bak蛋白被认为是细胞凋亡的核心，是调节线粒体通透性关键效应器，也是线粒体功能障碍导致精子凋亡的关键因子[26]。线粒体外膜的Bax或Bak寡聚形成小孔，释放细胞色素C并打开通透性转换孔复合体[23]。Bcl-2作为抗凋亡蛋白对精子的凋亡有抑制作用，其可抑制Bax和Bak的相互作用，减少通透性转换孔的开放。在凋亡的精母细胞中发现Bcl-2/Bax比值有降低趋势[27]，而后通过调节Bax和Bcl-2的表达可以减少精子凋亡，提高精子活力和卵裂率[28]。由此可见，精子凋亡一定程度上受控于Bcl-2/Bax比例。相关试验并未在冻融后的精子中检测到抗凋亡因子Bcl-2的存在，但体外单独添加Bcl-2可以有效降低凋亡率[21]。此外，Bik可以通过促进细胞内Ca2+的释放，破坏线粒体膜的通透性[16]，间接破坏线粒体结构影响凋亡的产生。上述研究表明，Bcl-2蛋白家族对精子凋亡具有调控作用，但具体的作用机制尚不明确，有待于进一步深入研究。

2 抗冻保护剂

2.1 常规抗冻保护剂

常规抗冻保护剂如甘油、二甲基亚砜（DMSO）和乙二醇等在生产上均可提高精子冻融后的使用效率。甘油作为一种渗透性抗冻保护剂，可进入精子膜内与水分结合降低冷冻液的渗透压，进而对精子起保护作用[29-30]。近期研究表明，甘油还可通过抑制caspase-2、caspase-8、caspase-13的表达进而抑制凋亡的产生[31]，但高浓度甘油可促进精子凋亡产生，其原因可能通过对线粒体的直接毒性作用而激活caspases[18]。DMSO作为一种渗透性低温保护剂，可替代甘油提高精子解冻后精液质量和繁殖能力，有效避免甘油的毒性作用[32]，还可抑制caspase-2和caspase-8的表达[31]。此外，添加乙二醇也可以显著提高精子线粒体完整性、精子活率，被认为是另一种可替代甘油的精液冷冻保护剂[33]。但是常规抗冻保护剂对精子的保护作用是有限的，同时添加抗氧化剂可以更有效地提高冻融后精子质量。

2.2 抗氧化剂