广东不同玉米基因型幼胚愈伤组织诱导差异研究

摘要 [目的]针对广东玉米品种建立高效遗传再生技术体系。[方法]以穗甜1号、广糯1号和广黑甜3个玉米品种的幼胚为外植体，研究N 6培养基中不同浓度的L-Pro、AgNO 3、2，4-D对愈伤组织诱导率和胚性愈伤率的影响。[结果]较高浓度的Pro（1 000～1 300 mg/L）有利于玉米愈伤组织诱导，而继代时在N 6培养基中添加29.43 μmol/L AgNO 3则可获得较多高质量的胚性愈伤组织;对3个玉米品种而言，培养基中2，4-D的适宜浓度为1～2 mg/L。3种基因型的外植体均可诱导出愈伤组织，但基因型和激素种类与浓度均影响愈伤组织诱导效率。[结论]在实际应用中，应根据不同基因型选择最佳的L-Pro、AgNO 3和2，4-D浓度配比，以获得较多高质量的胚性愈伤组织。

关键词 玉米;幼胚;愈伤组织;诱

中图分类号 S513  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）05-0085-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.05.022

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Differences of Callus Initiation from Immature Embryos Among Three Varieties of Maize in Guangdong

HE Hui-yi，CHEN Yong-sheng，CUI Fang-qing et al

（Institute of Nanfan & Seed Industry，Guangdong Academy of Sciences，Guangzhou，Guangdong 510316）

Abstract [Objective]To establish high-frequency regeneration technique system for gene tranformation in maize in Guangdong.[Method]The effects of different concentrations of L-Pro，AgNO 3 and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） in N 6 medium on both the callus induction rate and embryogenic callus rate were analyzed with the immature embryos of 3 maize varieties Suitian 1，Guangnuo 1 and Guangheitian used as materials.[Result]The results showed that the percentage of inducing callus was increased evidently with the addition of L-Proline （1 000-1 300 mg/L），and it was optimal for improving the induction percentage of embryogenic callus to add AgNO 3 （29.43 μmol/L） in N 6 medium during subculture;In addition，for 3 tested maize varieties，the most suitable concentration of 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） was 1-2 mg/L callus were grown from immature embryos of all the three genetypes，but both genotypes and types and concentrations of phytohormone affcted the frequency of embryogenic callus formation.[Conclusion]In practice，the optimal concentrations of L-Pro，AgNO 3 and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） were necessary to determined for different genotypes in callus induction in order to increase the induction percentage of embryogenic callus.

Key words Maize;Immature emhryos;Callus;Initiation

基金项目 国家现代农业产业技术体系（CARS201707）;国家自然科学基金项目（32072027）;广东省重点领域研发计划项目（2019B020238001）;广东省良种重大科研攻关项目（粤财农2019（73）号）。

作者简介 何慧怡（1981—），女，广东广州人，高级农艺师，硕士，从事生物育种研究。*通信作者，研究员，博士，从事生物育种研究。

收稿日期 2021-05-31

随着畜牧业的发展和人们生活水平的不断提高，玉米成为粮食、饲料、经济兼用的作物，在国民经济中占有愈来愈重要的地位[1]。其中，玉米组织培养和基因转化研究一直是国内外的研究热点之一[2-10]。自1975年Green等[2]利用玉米幼胚作为外植体进行愈伤组织的诱导并成功获得二倍体再生植株以来，国内科研人员相继以幼穗[3-4]、花药[5]、芽顶端分生组织[6]等作为外植体成功获得植株再生。然而，由于玉米幼胚具有接种方便及易于愈伤组织诱导等优点，因此，幼胚仍是目前玉米组织培养中广泛使用的外植体类型[4，8-10]。但是，不同基因型玉米幼胚组织培养的效率差异较大[4，11-12]，制约了幼胚在玉米基因工程研究中的应用。为了不断完善以玉米幼胚为外植体的组织培养技术，使其能更有效地在玉米基因工程上应用，该研究在前人研究的基础上[4，8-12]，采用L 9（33）正交试验设计了9种不同诱导培养基对3种不同类型的广东玉米品种（穗甜1号、广糯1号和广黑甜）进行诱导愈伤组织研究，旨在进一步探索建立高效遗传再生体系的条件，为建立高效的特定玉米品种转基因受体系统奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料包括3个玉米品种，分别为穗甜1号、广糯1号和广黑甜，2018年种植于广东省科学院生物工程研究所试验田块，8月进行人工授粉。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体幼胚的获取。在开花授粉期对3个品种进行人工套袋，均于授粉后第12天取雌穗剥去外层苞叶，在超净台上用75%乙醇浸泡5 min，再用无菌水冲洗3遍，然后用手术刀削去籽粒上端，使幼胚露出，接着用解剖针取出幼胚，盾片向上，接种到诱导培养基上。

1.2.2 愈伤组织诱导和继代。诱导和继代培养基是在N 6基础培养基中添加不同浓度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、硝酸银（AgNO 3）和L-脯氨酸（L-Pro），采用3因素3水平正交试验L 9（33）（表1），每处理接种20皿，每皿20个幼胚。7 d后及时切除胚根和胚芽进行一次继代培养，14 d后统计愈伤组织诱导率和胚性愈伤率，确定最适宜的配比浓度。

1.2.3 培养条件。诱导培养和继代培养均为暗培养，温度为（28±1）℃。

2 结果与分析

2.1 穗甜1号愈伤诱导方差分析

2.1.1 显著性。由于区组和C因素项的均方与误差均方差

异不大，所以计算合并误差均方进行F测验（当方差分析遇到某变异项的均方与误差均方相差不大，特别是小于误差均方时，常将该项平方和与误差平方和合并相加，其相应的自由度也合并相加，求得合并误差均方，以提高F测验的精度[13]）。结果表明，穗甜1号在胚性愈伤率方面，A、B因素各水平间达到极显著，而在愈伤组织诱导率方面，A、B和C 3因素各水平间都达到显著或极显著（表2）。因此，分别对穗甜1号胚性愈伤率和愈伤组织诱导率的显著因素水平进行多重比较，结果见表3、4。

2.1.2 A、B因素各水平间胚性愈伤率比较。由表3可知，在A因素方面，穗甜1号A 2和A 3处理的胚性愈伤率分别极显著和显著高于A 1，而A 2和A 3之间无显著差异;在B因素方面，穗甜1号B 2处理的胚性愈伤率分别显著和极显著高于B 3和B 1，B 3的胚性愈伤率极显著高于B 1。

从表2方差分析结果中各因素的F值大小可确定穗甜1号在胚性愈伤率方面的因素主次顺序为B、A、C;根据多重比较结果（表3）可知，A因素最优水平为A 2，B因素最优水平为B 2，C因素不显著，其因素水平可任取，故该试验穗甜1号胚性愈伤率的最优处理组合为A 2B 2C 0，即最优处理组合是1 000 mg/L L-Pro，29.43 μmol/L AgNO 3，2，4-D 3种浓度均可。

2.1.3 A、B、C因素各水平间愈伤组织诱导率比较。由表4可知，在A因素方面，穗甜1号A 3处理的愈伤组织诱导率显著高于A 1，A 2介于A 1和A 3之间，且与A 1、A 3之间均无显著差异;在B因素方面，穗甜1号B 2和B 1处理的愈伤组织诱导率分别极显著和显著高于B 3，而B 2和B 1之间无显著差异;在C因素方面，穗甜1号C 2和C 3处理的愈伤组织诱导率均显著高于C 1，而C 2和C 3之间无显著差异。

从方差分析结果（表2）中各因素的F值，可确定穗甜1号在愈伤组织诱导率方面的因素主次顺序亦为B、A、C;根据表4的多重比较结果可知，A因素最优水平为A 3，B因素最优水平为B 2，C因素较优水平为C 2和C 3，故该试验穗甜1号在愈伤组织诱导率方面的最优处理组合应为A 3B 2C 2或A 3B 2C 3，即最优处理组合是1 300 mg/L L-Pro，29.43 μmol/L AgNO 3，2或3 mg/L 2，4-D。

2.2 广糯1号愈伤诱导方差分析

2.2.1 正交试验结果及显著性。根据广糯1号愈伤诱导正交试验结果进行方差分析，结果见表5。由表5可知，广糯1号在胚性愈伤率方面，B、C因素各水平间达到极显著，而在愈伤组织诱导率方面，B因素各水平间达到极显著。因此，分别对广糯1号胚性愈伤率和愈伤组织诱导率的显著因素水平进行多重比较，结果见表6、7。

2.2.2 B、C因素各水平间胚性愈伤率比较。由表6可知，在B因素方面，广糯1号B 2处理的胚性愈伤率分别显著和极显著高于B 3和B 1，B 3的胚性愈伤率极显著高于B 1;在C因素方面，广糯1号C 2处理的胚性愈伤率极显著高于C 3和C 1，C 3和C 1间的胚性愈伤率无显著差异。

从方差分析结果（表5）中各因素F值大小可确定广糯1号在胚性愈伤率方面的因素主次顺序为B、C、A，其中A因素不显著，因此其水平可任取。由表6可知，B因素最优水平为B 2，C因素最优水平为C 2，故该试验广糯1号在胚性愈伤率方面的最优处理组合应为A 0B 2C 2，即最优处理组合是L-Pro 3种浓度均可，29.43 μmol/L AgNO 3，2 mg/L 2，4-D。

2.2.3 B因素各水平间愈伤组织诱导率比较。由表7可知，在B因素方面，广糯1号B 1和B 2处理的愈伤组织诱导率间无显著差异，但均极显著高于B 3。

从方差分析结果（表5）中各因素F值大小可确定广糯1号在愈伤组织诱导率方面的因素主次顺序为B、C、A;由于A、C因素均不显著，因素水平均可任取，B因素B 1和B 2水平较优，故广糯1号在愈伤组织诱导率方面的最优处理组合应为A 0B 1C 0或A 0B 2C 0，即最优处理组合是L-Pro和2，4-D 3种浓度均可，不添加AgNO 3或AgNO 3浓度为2943  μmol/L。

2.3 广黑甜愈伤诱导方差分析2.3.1 正交试验结果及显著性分析。F测验结果（表8）表明，广黑甜在胚性愈伤率和愈伤组织诱导率方面，A、B、C 3因素各水平间均达到极显著差异，因此，分别对广黑甜胚性愈伤率和愈伤组织诱导率的各因素各水平进行多重比较，结果见表9、10。