亚硝酸盐处理对PVY和TuMV的钝化作用研究

摘要 为了探究化学试剂处理对植物病毒的钝化作用，以马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）和芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus，TuMV）为试验对象，在模式植物本氏烟上研究了亚硝酸盐处理对病毒的钝化作用。结果表明，亚硝酸盐处理PVY后，PVY在本氏烟植株上比清水处理的对照表现出发病症状减轻，甚至不发病现象。而清水处理的对照烟草对PVY病毒比较敏感，植株逐渐形成系统性侵染并最终坏死。亚硝酸盐处理TuMV后，未观察到病毒侵染的症状，也未检测到TuMV病毒。Western blot技术检测亚硝酸盐处理组病毒含量远低于清水处理组，接近健康水平。表明亚硝酸盐对PVY和TuMV具有一定的钝化作用。

关键词 马铃薯Y病毒;芜菁花叶病毒;亚硝酸盐;钝化作用

中图分类号 S 432.4+1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）06-0129-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.06.030

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Passivation of  PVY  and  TuMV  by  Nitrite  Treatment

ZHAO Kai， WANG Hai-juan， ZHANG Ji-dan et al

（College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010019）

Abstract In order to explore the inactivation effect of chemical reagents on plant viruses， we used potato virus Y （PVY） and turnip mosaic virus （TuMV） as test objects. The inactivation effect of nitrite treatment on the virus was studied. The results of the study showed that after nitrite treatment of PVY， PVY on Ben’s tobacco plants showed a reduction in the onset of symptoms compared with the control treated with water， or even no onset. On the other hand， the control tobacco treated with clean water was more sensitive to PVY virus， and the plant gradually formed a systemic infection and eventually necrosis. After nitrite treatment of TuMV， no symptoms of virus infection were observed， and there was no detected TuMV virus. Western blot technology detected that the virus content of the nitrite treatment group was far lower than that of the water treatment group， which was close to a healthy level. The above results all showed that nitrite had a certain passivation effect on PVY and TuMV.

Key words Potato virus Y;Turnip mosaic virus;Nitrite;Inactivation

基金项目 内蒙古农业大学高层次人才引进科研启动项目（NDGCC-2016-23）。

作者简介 赵凯（1997—），男，内蒙古巴彦淖尔人，硕士研究生，研究方向：植物病毒学。*通信作者，教授，从事植物病毒学研究。

收稿日期 2021-07-09

马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（ Potyvirus ）中最具代表性的一员[1]。Smith于1931年首次在马铃薯中发现。其在我国具有分布广、寄主多、危害重的特点。PVY可以自然侵染茄科、豆科等9个科的植物，其中包括马铃薯、烟草、番茄、辣椒等重要经济作物，大丽花和矮牵牛花等观赏植物，以及一些野生杂草[2]，但又在不同寄主或者相同寄主的不同品种上表现出不同的症状。PVY被认为是对马铃薯危害最严重的病毒，自20世纪80年代以来在欧洲和其他大陆广泛流行[3]，在90年代成为主要烟草病害[4]，且呈日益严重的趋势。

在生产中PVY对烟草产量和品质构成极为严重的威胁[5]，PVY一旦侵染烟草后，轻型株系发病初期在新叶上出现“明脉”症状，然后发展为系统斑驳，不久之后便形成花叶型斑驳，随后叶脉间颜色变淡，叶脉两侧的组织呈深绿色带状;重型株系侵染的烟株，叶脉变成深褐色或黑色，坏死斑常延伸到中脉，甚至进入茎的维管束组织和髓部，引起叶片和茎的坏死，引起产量损失可达25%～45%[6]，危害严重的地块，可造成绝收，直接导致烟叶质量下降[7]。

芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus，TuMV）也属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属，为单链正链RNA病毒。其最先发现于美国，随后迅速向欧洲和亚洲蔓延，早在20世纪70年代，TuMV在我国甘蓝生产上经常发生，进入80年代后在全国各地普遍流行。TuMV易产生变异，存在多种株系（strain）和致病型（pathotype）[8]。植物感染TuMV后体内会出现一系列生理生化变化，包括病变细胞质内分布有大量线形病毒粒子和柱状内含体。叶绿体片层结构发育差，淀粉粒积累减少，叶绿素含量、光合速率、气孔导度、蒸腾速率比对照明显降低。后期畸形肿胀，膜结构破裂直至解体，酶系活性改变，引起代谢紊乱，从而影响植物生长发育，造成作物减产，严重时减产50%以上[9]。

烟草作为世界上广泛种植的重要经济作物之一，病害种类多。由于病毒在植物细胞中属于专性寄生，其自身无能量代谢系统，然而对寄主植物细胞具有较高的依赖性，因此人们对植物病毒病的防治尤为困难，至今尚无完全有效的化学防治药剂[10]。近年来，以钝化病毒和诱导植物抗性为理论基础的病毒钝化剂的研发及应用逐渐成为植物病害防治的新途径。这一类药剂通过钝化病毒活性，可有效地破坏植物病毒基因和病毒细胞，抑制病毒复制。它们通过抑制病毒核酸和蛋白质的合成，控制病毒增殖;并能在植物体内形成一层“致密的保护膜”，阻止病毒二次侵染[11]，从而使病毒侵染能力下降。张秀华等[12]研究表明亚硝酸盐处理能够降低病毒毒性，引起碱基脱胺，使腺嘌呤变为次黄嘌呤，鸟嘌呤变为黄嘌呤，胞嘧啶变为尿嘧啶，从而改变病毒核酸的遗传密码，使病毒发生变异。

笔者利用亚硝酸盐预先处理常见病毒PVY和TuMV，之后在本氏烟上进行摩擦接种，最后检测亚硝酸盐处理对2种病毒的体外钝化作用，以期为化学试剂防治PVY和TuMV提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本氏烟（ Nicotiana benthamiana ）由笔者所在实验室提供。在温度22 ℃、光照16 h/d的温室中进行培养。当生长至4～5片叶龄时，挑选大小一致的植物用于试验。

马铃薯Y病毒（PVY）采用携带有Ros基因的病毒株，由西班牙Jose Antonio Daros教授提供。芜菁花叶病毒（TuMV）采用含GFP标记的病毒株，由中国科学院动物研究所张晓明课题组提供。

2种病毒在本氏烟上扩繁后，将病毒侵染后表现症状明显的烟草系统叶片进行采样，用液氮在研钵中研磨成粉末，在-80 ℃超低温冷冻保存作为毒源备用。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒接种。

病毒接种方法采用人工机械摩擦接种方法。称取0.1 g毒源加入200 μL磷酸缓冲液（PBS，pH=72），充分混匀，7 000 r/min离心10 min，即得病毒粗提取液，取上清置于冰盒备用。选取长势一致的4～5叶期本氏烟，在顶端对生的2片功能叶做好接种标记，接种前在待接毒叶片上撒600目石英砂（或 Al2O3）少许，每片叶子接种20 μL的PVY粗提液。用左手托着叶片，右手食指在叶片中部轻轻摩擦，摩擦过程中一定要注意力度，切忌反复大力摩擦，使叶片表面细胞造成微伤口，摩擦均匀。完成后用清水喷洒植物以除去叶片上的石英砂，覆上黑膜进行保湿，遮光处理24 h后揭膜，在22 ℃条件下培养，10 d后观察其发病情况。

1.2.2 亚硝酸盐处理病毒。

参照张秀华等[12]的方法，用粗提PVY病毒粗悬液2 mL，加4 mol/L NaNO2 1 mL和1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 4.0）1 mL，使混合液pH维持4.3;处理10～20 min。处理完毕后，以0.066 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）稀释50～100倍，使反应液pH中和至7.0以终止反应[13]。然后经实验室接种试验，以清水处理的PVY毒源摩擦为对照。观察各处理烟草症状，并拍照记录。

1.2.3 Western blot检测病毒含量。

将烟草植株发病叶片采集后，研磨成粉末，Western Blot法检测病毒含量。具体步骤：使用UREA缓冲液提取蛋白质，并在12% SDS/PAGE中进行电泳，然后转移至PVDF膜中。通过丽春红染色10 min检查蛋白质转移情况，然后通过蒸馏水洗涤将膜完全脱色。将膜放在封闭溶液中，在室温下摇床上封闭2 h。用TBS短暂冲洗膜3次，每次10 min，然后添加一抗，PVY-CP（1∶1 000）和GFP抗体（1∶5 000）在4 ℃过夜孵育。用TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min后，在室温下将膜在二抗（山羊抗兔，1∶5 000）中孵育1 h。用TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min，最后加入ECL显色液，在近红外双色激光和化学发光双功能成像系统上观察蛋白条带。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐处理对PVY的钝化作用

亚硝酸盐处理PVY病毒后再接种到24株本氏烟植株上，以清水处理的PVY毒源为对照。接种后分别在5、7、10、14 dpi下观察各处理烟草的症状表现，并拍照记录（表1）。10 dpi时，亚硝酸盐处理PVY，PVY在烟草植株上没有表现出病毒症状（图1A）。而清水处理的PVY毒源对照在烟草植株发病严重，表现出病毒系统性侵染症状（图1B）。

当供试植株在温室条件下继续生长到接种PVY病毒后20 dpi时，发现亚硝酸处理PVY的植株仍未出现症状，与侵染10 dpi时无显著区别（图2A）。清水处理的对照组植株表现出明显的病毒侵染症状（图2B）。

供试植株的系统叶片在10和20 dpi时进行取样，采用western blot 技术检测叶片病毒积累量，结果发现亚硝酸盐处理PVY的系统叶片样品中未检测到病毒含量。然而，清水处理的对照植物中含有大量的PVY（图3）。同时，病毒在20 dpi时的含量大于10 dpi的病毒含量。这说明随着时间的延长，植株体内病毒含量也在积累，表现为植株系统发病、加速坏死。然而亚硝酸处理组都不含有病毒，说明亚硝酸对PVY病毒有一定的钝化作用，预先处理PVY后再摩擦接种可以抑制病毒的侵染。