基于苹果DNA的NFC苹果汁鉴伪方法的建立

摘要 [目的]通过分析比较不同品种苹果的NFC与FC果汁在DNA方面的差异，为NFC果汁的真伪鉴别和NFC果汁标准的建立提供科学方法和试验依据。[方法]在传统CTAB提取DNA方法的基础上加入纳米硅基磁珠（Si-OH@Fe3O4 NPs）以提高苹果汁DNA的提取浓度，开发实时定量PCR，以鉴别NFC苹果汁和掺假（AAJ）果汁。[结果]试验确定的磁珠提取DNA最佳条件是样品用量1 mL和颠倒混匀3 min，提取出的DNA浓度均在50～60 ng/mL;在NFC苹果汁中连续稀释DNA的RT-PCR扩增标准曲线是y=-2.095 9x+30.714 0，R2=0.998 5;不同程度掺假NFC苹果汁中DNA的RT-PCR扩增曲线为y=0.968 3x+28.591 0，相关性为R2=0.981 9。[结论]这种基于新的DNA提取方法的RT-PCR技术在NFC苹果鉴伪中有着良好的稳定性、可重复性、可靠性;试验建立的方法可为NFC果汁的鉴伪检验提供有用工具。

关键词 苹果;DNA;NFC苹果汁;掺假果汁;鉴伪

中图分类号 TS 255.7  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）09-0157-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment of Authentication Detection Methods for NFC Apple Juice Based on DNA of Apples

DENG Hong1，2，3， LIU Liang1， LEI Jia-lei1，4 et al

（1. College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xi’an， Shaanxi 710062;2. National Research & Development Center of Apple Processing Technology， Xi’an， Shaanxi 710119;3. Engineering Research Center of High Value Utilization of Western China Fruit Resources， Ministry of Education， Xi’an， Shaanxi  710119; 4.Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723001）

Abstract [Objective]The differences of DNA between NFC juice and FC juice from different apple varieties were analyzed and compared to provide scientific method and experimental basis for the authentication detection of NFC juice and the establishment of NFC juice standard. [Method]The extraction concentration of juice DNA can be greatly improved after adding silicon based magnetic beads （Si-OH@Fe3O4 NPs） based on CTAB for DNA traditional extraction method， then the real-time quantitative PCR was developed to identify NFC apple juice and adulterated apple juice. [Result]The experiment results showed the optimal conditions for extracting DNA in NFC apple juice by magnetic beads were 1 mL of sample dosage and 3 min of reverse mixing， and the extracted DNA concentration was 50-60 ng/mL under above operating conditions. The standard curve for RT-PCR amplification of continuously diluted DNA from NFC apple juice was y = -2.095 9x +30.714 0， R2=0.998 5. The RT-PCR amplification curve of DNA in adulterated fruit juice （AAJ） with different degrees adulterated FC juice was y = 0.968 3x+28.591 0， R2=0.981 9. [Conclusion]RT-PCR based on the new DNA extraction method has good stability， repeatability and reliability in NFC apple forgery identification. The method established in this experiment can provide useful tools for NFC apple fruit juice authentication detection.

Key words Apple;DNA;NFC apple juice;Adulterated apple juice;Authentication detection

近年来，随着人们健康意识的不断提高，完全保留了水果原有新鲜风味的NFC（not form concentrate，非浓缩还原汁）苹果汁的销量日益增高。NFC是将新鲜原果清洗后榨出果汁，经瞬间杀菌后直接罐装（不经过浓缩及复原）的纯鲜果汁。由于NFC果汁高昂的售价和广阔的市场背景，成为市场竞争不法之人掺假的目标[1-2]。市场上绝大多数的所谓纯鲜果汁，其实是将FC果汁（Form concentrate，浓缩还原果汁）兑水加糖、防腐剂等制成的AAJ果汁（adulterated apple juice，掺假果汁）。AAJ果汁经过浓缩与还原的复杂加工，其新鲜度及口感均无法与NFC产品相比。

而作为我国苹果生产加工大省的陕西，2019年苹果产量达到1 135.58万t，种植面积61.46万hm2。除部分鲜食出口外，很多品质良好但外形欠佳的苹果被加工为果汁[3-4]。据统计，全球每年消耗超过1 600万t的果汁中苹果汁占有重要的市场份额，因此NFC苹果汁的真实性问题一直为广大消费者所关注。由于NFC与FC果汁的化学成分差异不大，传统的物理与化学分析方法很难区分FC与NFC果汁产品，所以目前主要利用稳定同位素技术（如同位素比率质谱法，isotope ratio mass spectrometry，IRMS）进行FC与NFC的鉴伪[5-9]。这种方法已经获得了欧盟标准化委员会（法文缩写CEN，Comité Européen de Normalisation）、美国分析化学师协会（Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）的认可。然而，IRMS方法用于FC与NFC的定性分析比较好，其定量分析效果仍不尽人意。

而利用基于DNA的分子生物学手段进行品种鉴定、掺假检测已经成为研究热点[10-11]。高华[11]利用SSR分子标记技术，以40个苹果栽培品种为试材，通过PCR反应体系优化、引物筛选和标记筛选，建立了一套适合于苹果DNA指纹图谱库构建的技术体系。刘伟红等[12]以橙汁为研究对象，采用CTAB法、SDS-CTAB法以及改良CTAB法（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）提取其DNA，同时选取橙UDP-葡糖基转移酶蛋白基因设计柑橘属植物特异性扩增引物，证明UGT基因特异性引物可用于果汁中的柑橘属植物成分的检测及鉴伪。目前有关不同品种苹果汁NFC与FC中DNA差异的研究在国内尚属空白，关键的DNA提取技术仍是瓶颈，因此提取苹果汁DNA进行苹果汁鉴伪的研究目前鲜见报道。

笔者利用改良CTAB法和纳米硅基磁珠（Si-OH@Fe3O4 NPs）吸附解决苹果汁中DNA的提取难题，通过RT-PCR技术对NFC和FC苹果汁中的DNA进行定量分析，实现NFC苹果汁的鉴伪与鉴定，以期为苹果NFC果汁的质量监控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果原料品种10个（自由、延光、橘苹、富士、寒福、黛绿、嘎啦、首红、乔纳金、元帅），采于西北农林科技大学白水苹果试验站，并于4 ℃冷藏保存。纳米硅基磁珠（Si-OH@Fe3O4NPs），磁力架，购于厦门普瑞迈格生物科技有限公司。2×Easy Taq PCR SuperMix，DNA Marker，DNA free water，Plantzol试剂盒，RNaseA均购自北京全式金生物技术有限公司;引物合成及DNA测序在金斯瑞公司进行。

PCR仪，ABI公司;电泳仪，BioRad公司;SBA-40C葡萄糖测定仪，山东省科学院;凝胶成像分析仪，上海培清科技公司;CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪，Bio-rad公司;JEM-1230透射电子显微镜，日本东京JEOL公司。

1.2 试验方法

1.2.1  NFC、FC、AAJ苹果汁的制备。

NFC、FC苹果汁的制备参照文献[2]，AAJ苹果汁的制备参见文献[9]。

1.2.2 不同品种苹果汁中DNA的提取与分析。

1.2.2.1 DNA的提取。

参照文献[13-14]，取1 mL样品，12 000  r/min离心10  min后弃上清液，然后加入400 μL Plantzol，振荡混匀，使样品完全悬浮，再加入7.5 μL RNaseA，充分混匀，55 ℃金属浴温育15 min;加入400 μL酚-氯仿，振荡混匀，12 000  r/min离心10  min，小心吸取上层水相于干燥离心管中，加入400 μL异丙醇，再加入振荡混匀的20 μL Si-OH@Fe3O4NPs，颠倒混匀2 min，将离心管置于磁力架上，静置3 min，吸弃上清液;加入800 μL 70%乙醇水溶液，振荡混匀，将离心管置于磁力架上，静置3 min，吸弃上清液，再加入800 μL 70%乙醇水溶液，重复操作2次;65 ℃金属浴干燥8 min，挥发表面乙醇;移去磁力架，加入50 μL TE液，用移液枪吹打使其分布均匀，65 ℃金属浴温育10 min，温育期间每隔2～3 min轻摇离心管混匀;将离心管置于磁力架上，静置3 min使磁珠吸附在离心管壁上。吸取上清液至一新的离心管，得到DNA。其中，NFC果汁即鲜榨苹果汁提取后得到的DNA浓度≥40 ng/μL。使用分光光度计，通过在260和280 nm处的吸光度读数控制总DNA的浓度和纯度。在吸附DNA之前和之后，在JEM-1230透射电子显微镜上对磁珠的TEM图像进行成像。Si-OH@Fe3O4NPs提取DNA的整个过程见图1。