药物对多子小瓜虫感染的草鱼体表黏液及酶活的影响

摘要 为探究草鱼（Ctenopharyngodon idella）感染多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）体表黏液的分泌及调控机制，设计了3个预防组，分别对健康草鱼投喂添加维生素C 500 mg/kg饲料15 d，水体泼洒五倍子2 mg/L、硫酸铜1 mg/L连续预防5 d后再感染多子小瓜虫5 d;以及3个治疗组，对健康草鱼感染多子小瓜虫5 d后再分别按上述药物进行内服或外用治疗5 d。定期测定草鱼体表黏液中的酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）的酶活、黏液细胞密度和Muc5B基因的相对表达量。结果表明，3个预防组的草鱼黏液中的ACP、AKP酶活普遍显著上升（P<0.05），五倍子和硫酸铜组的LZM酶活显著上升（P<0.05）。除五倍子组外，其余预防组Muc5B基因表达量均显著上升（P<0.05）。维生素C治疗组的草鱼黏液ACP、AKP酶活均显著上升，硫酸铜治疗组的草鱼体表黏液中仅AKP酶活显著上升（P<0.05）。饲料中添加维生素C显著提高草鱼体表黏液中的酶活、黏液细胞密度和Muc5B基因的相对表达量，有效促进草鱼体表黏液的分泌调控，对抑制多子小瓜虫侵染的效果显著。

关键词 草鱼;多子小瓜虫;体表黏液;Muc5B基因

中图分类号 S943  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）10-0063-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.016

Effects of Drugs on Mucus and Enzyme Activity of Ctenopharyngodon idellus Infected by Ichthyophthirius multifiliis

LIU Fang-ling1，2， LI Chen-yang1， ZHANG Zhe-pan1 et al

（1.Zhejiang Normal University， Jinhua，Zhejiang  321004;2. Key Laboratory of Wildlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province，Jinhua， Zhejiang  321000）

Abstract In order to explore the secretion and regulation mechanism of Ctenopharyngodon idella infection with Ichthyophthirius multifiliis， three prevention groups were designed in this study. Healthy Ctenopharyngodon idella were fed with 500 mg/kg diet supplemented with vitamin C for 15 days， and water body was daubed with 2 mg/L Chinese gallnut and 1 mg/L copper sulfate for continuous prevention for 5 days. Ichthyophthirius multifiliis was used for infection for 5 days. And three treatment groups were treated with healthy Ctenopharyngodon idella with Ichthyophthirius multifiliis for 5 days， followed by oral or topical treatment for 5 days， respectively. The activities of acid phosphatase （ACP）， alkaline phosphatase （AKP）， lysozyme （LMZ）， the density of mucus cells and the relative expression of Muc5B gene in the mucus of Ctenopharyngodon idella were determined regularly. The results showed that the activities of ACP and AKP in the Ctenopharyngodon idella mucus of the three prevention groups were significantly increased （P<0.05）， the activity of LZM enzyme in Chinese gallnut and copper sulfate groups was significantly increased （P<0.05）. The expression of Muc5B gene in all prevention groups except Chinese gallnut group was significantly increased （P<0.05）. The activity of ACP and AKP in mucus of grass carp in vitamin C treatment group was significantly increased， while the activity of AKP in mucus of Ctenopharyngodon idella in copper sulfate treatment group was significantly increased （P<0.05）. The supplementation of vitamin C significantly increased the enzyme activity， mucus cell density and the relative expression of Muc5B gene in the mucus surface of Ctenopharyngodon idella， and effectively promoted the secretion regulation of mucus surface of Ctenopharyngodon idella. The effect on inhibiting the infection of Ichthyophthirius multifiliis was remarkable.

Key words Ctenopharyngodon idella;Ichthyophthirius multifiliis;Mucus on body surface;Muc5B gene

基金项目 浙江省重点研发计划项目（2019C02049，2020C02014） 。

作者简介 刘芳玲（1997—），女，浙江金华人，硕士研究生，研究方向：水生动物病害。通信作者，副教授，硕士，硕士生导师，从事水生动物病害研究。

收稿日期 2021-09-02

鱼类的黏膜免疫系统（mucosal immune system）包括鱼类的鳃、皮肤和肠道黏膜组织是抵御外界病原侵袭的第一道防线，鱼类鳃、皮肤黏膜组织不仅具有物理屏障作用，还具有特异性及非特异性免疫应答[1-2]。鱼类表皮层中杯状细胞和腺细胞具有分泌黏液的功能，其中含有多种抗菌酶以及其他广谱性的抗细菌、真菌成分，分泌到体表的黏液具有物理性凝结沉淀外源性侵袭原及润滑作用;鱼类皮肤组织及其分泌黏液中存在多种非特异性免疫因子，主要包括酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）、凝集素、抗菌肽等，具渗透调节、运动、抵御微生物入侵等功能[3-7]。

多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）是一种纤毛类原生动物，主要寄生在淡水鱼类的体表和鳃丝，由于缺乏安全有效的治疗药物，给水产养殖造成较大的经济损失[8]。而通过调控鱼类体表黏液分泌，激活鱼类体表的黏膜免疫，阻止或抵御多子小瓜虫的入侵，可在一定程度上降低多子小瓜虫的危害[9]。研究表明，维生素C具有一定促进体表黏液的分泌，Dawood等[10]在真鲷（Pagrus major）的饲料中添加维生素C和β-葡聚糖后，发现真鲷皮肤黏液分泌显著增加。硫酸铜也可促进鱼体表黏液分泌增多，鳃丝黏液分泌亢进[11]。五倍子含有60%～80%的鞣酸，可使鱼体皮肤黏膜腺细胞蛋白发生凝固，引起黏液分泌抑制[12]，硫酸铜和五倍子对多子小瓜虫掠食体有一定的杀灭作用[13]，Zhang等[14]研究发现，从五倍子中分离得到的五倍子葡萄糖（pentagall oylglucose）当其使用浓度为2.5～20.0 mg/L时对小瓜虫掠食体的杀灭率为100%。因此，笔者选取上述3种药物对多子小瓜虫感染草鱼（Ctenopharyngodon idella）前后的体表黏液分泌开展研究，以期为鱼类寄生虫病的防控研究提供理论支撑与实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康草鱼来自浙江省金华市金农鱼种场，规格（180±30）g。多子小瓜虫为笔者所在实验室传代培养。

主要试剂：酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶测试盒（南京建成生物工程研究所）;Animal Total RNA Isolation Kit（Foregene），DNA提取试剂盒（上海生工生物技术有限公司）;HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit，2×UltraSYBR Mixture（High ROX）（北京康为世纪生物科技有限公司）;维生素C（含量90%，华北制药股份有限公司）、五倍子（含量25%，山西首爱）、五水硫酸铜（含量95%，山东习化生物科技有限公司）。PCR引物的合成委托上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 试验方法

试验在室内养殖桶内进行，每个养殖桶内放养20尾健康草鱼，暂养2 d后进行试验。预防试验分别外用五倍子（2 mg/L）5 d、硫酸铜（1 mg/L）5 d和内服维生素C（500 mg/kg）15 d，各设一个空白对照组及阳性对照组，每组3个平行。预防用药结束后再用多子小瓜虫掠食体（3 000个/尾）感染5 d。

治疗试验，先用多子小瓜虫掠食体（3 000个/尾）感染5 d，再分别投喂维生素C（500 mg/kg）、外用五倍子（2 mg/L）和外用硫酸铜（1 mg/L），连续处理5 d，各设一个空白及阳性对照组，每组3个平行。

试验水温25 ℃，养殖桶有独立增氧及进排水系统，蓄水250 L。日投喂饲料（浙江粤海淡水鱼饲料，粗蛋白含量28%）按体重0.5%计，每天投喂1次，每天更换新水100%。

预防组在开始小瓜虫攻毒之后，每天记录草鱼的存活数量并计算成活率，持续10 d，空白对照组为预防对照;治疗组在开始用药之后，每天记录草鱼的存活数量并计算成活率，持续10 d，阳性对照组为治疗对照。

1.3 酶活指标测定

分别在药物处理及多子小瓜虫感染前后，各取3尾草鱼的背部体表黏液进行酶活测定。先用吸水纸擦干草鱼体表水分后，用玻片刮取背部黏液1 mL于离心管，PBS缓冲液10倍稀释并匀浆，转速4 000 r/min离心5 min，取离心后黏液上清液进行酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）的酶活测定，在520 nm波长下测定ACP、AKP酶活测量体系的OD值，在530 nm波长下测定LZM酶活测量体系的OD值，并按照相应公式计算酶活。

1.4 RT-qPCR检测

分别提取草鱼背部皮肤的RNA，用核酸定量仪和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和完整性，反转录合成cDNA。根据草鱼Muc5B基因cDNA序列，Primer Premier 5设计合成正反向特异荧光定量引物Muc5B，且以内参基因β-actin作为对照。各引物序列：Muc5B（F：5′-TACAATGGCGACAAGGATGA-3′，R：5′-CACTAAACCCTGGACTGCTGA-3′）;β-actin（F：5′-CTGTATGCCTCTGGTCGT-3′，R：5′-GCTGTAGCCTCTCTCGGT-3′）。每样3个重复，采用2-ΔΔCt方法分析所得数据，计算Muc5B基因的相对表达水平，阳性对照组分别记录为感染5和10 d。