1株异养硝化-好氧反硝化神户肠杆菌的鉴定及脱氮特性

摘要 [目的]鉴定1株异养硝化-好氧反硝化神户肠杆菌，明确其脱氮特性。[方法]从养殖池塘底泥中筛选到1株异养硝化-好氧反硝化菌HD-NAH，经形态学观察、生理生化试验以及16S rDNA序列分析，鉴定为神户肠杆菌（Enterobacter kobei）HD-NAH，并研究其脱氮特性。[结果]该菌在以柠檬酸钠为碳源，C/N为18，初始pH为7，温度为27 ℃，转速为190 r/min时，24 h亚硝氮（NO2--N）和总氮（TN）降解率分别为99.98%和89.37%，具有较高的降解效率。菌株在初始pH为7～10，温度为27～37 ℃，转速为130～210 r/min时，对NO2--N和TN的降解率均较高，表明该菌株的环境适应性较强。在不同氮源条件下，菌株HD-NAH对氮的去除存在差异，其对TN去除率表现为NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH+4-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N，还存在一定短程异养硝化-好氧反硝化过程。[结论]菌株HD-NAH良好的脱氮特性可为养殖废水除氮提供可选择材料。

关键词 神户肠杆菌HD-NAH;异养硝化;好氧反硝化;脱氮特性

中图分类号 X172  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）10-0070-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.018

Identification of a Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrifying Bacterium and Its Removal Characteristics of Nitrogen

HU Dan1，2，HE Fu-qiang1，DU Quan-neng3 et al （1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128; 2.Hunan Institute of Microbiology，Changsha，Hunan 410009; 3.Haida Research Institute of Guangdong Haida Group Co.，Ltd，Guangzhou，Guangdong 511400）

Abstract [Objective]To identify a heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacterium，and clarify its denitrification characteristics.[Method]A heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacterium was screened from the sludge of aquaculture pond，was named as HD-NAH.The strain was identified as Enterobacter kobei by morphological observation，physiological and biochemical tests，and 16S rDNA sequence analysis.The removal characteristics of nitrite nitrogen and total nitrogen by HD-NAH were studied.[Result]The results showed that degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen by strain HD-NAH were 99.98% and 89.37% respectively，under the conditions of trisodium citrate as the sole carbon source，C/N 18，pH 7，appropriate culture temperature 27 ℃ and shaking speed 190 r/min.The strain HD-NAH had preferable degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen under pH 7-10，temperature 27-37 ℃，and shaking speed 130-210 r/min，it means that strain HD-NAH has strong environmental adaptability.The degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen were measured under different nitrogen source，the rate was arranged as：NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH+4-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N.The strain showed a certain short-range heterotrophic nitrification-aerobic denitrification process.[Conclusion]It provided an alternative material for the denitrification of aquaculture wastewater basing on good denitrification characteristics of the strain HD-NAH.

Key words Enterobacter kobei HD-NAH;Heterotrophic nitrification;Aerobic denitrification;Denitrification characteristics

基金项目 湖南省重点研发项目（2016NK2103）;湖南创新型省份建设经费资助项目（2020NK2029）。

作者简介 胡丹（1989—），女，湖南桃江人，助理工程师，硕士，从事环境重金属检测研究。 通信作者，副教授，从事微生物资源利用研究。

收稿日期 2021-07-06

水体氮元素的大量累积会造成水体富营养化和生态失衡等一系列问题，严重威胁水生生物的生存和健康，制约我国养殖业的持续发展。在处理水体氮污染过程中，微生物起着重要作用，可通过氨化、硝化和反硝化等过程减少水体中的氮含量，从而达到脱氮目的[1]。传统认为微生物的硝化和反硝化是2个独立的过程，直到1984年，Robertson等[2]发现一种能进行异养硝化-好氧反硝化的脱氮副球菌（Paracocci denitrificans），并提出了异养硝化-好氧反硝化的概念。异养硝化-好氧反硝化细菌可在有氧条件下利用有机碳源和有机氮源进行生长，在降低有机物含量的同时，利用自发反应去除水体中有毒的氨氮与亚硝酸盐氮，且除氮率高、除氮速率快，避免了二次污染，受到广泛关注[3-5]。

异养硝化-好氧反硝化细菌的发现，为生物脱氮提供了新的研究方向。近年来，许多研究者从自然界分离了诸多异养硝化-好氧反硝化菌并对其脱氮进行了研究，包括假单胞菌（Pseudomonas sp.）[6]、无色杆菌（Achromobacter sp.）[7]、芽孢杆菌（Bacillus sp.）[8]、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）[9]和农杆菌属（Agrobacterium sp.）[10]等细菌及皱褶念珠菌（Diutina rugosa）[11]等真菌。一些细菌在实际水体的应用中取得了良好效果，如魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）SF16对含盐废水的氨氮和总氮去除率分别达到97.14%和73.92%[12]，Acinetobacter sp.T1能够明显提高养猪场废水中的氮去除率[13]。因此，筛选出更多高效除氮的菌种资源，对于利用微生物进行氮污染环境修复有着重要意义。该研究从淡水养殖池塘底泥中分离到1株高效异养硝化-好氧反硝化菌株HD-NAH，经形态学观察、生理生化试验并结合16S rDNA序列分析，鉴定为神户肠杆菌，目前有关该菌用于生物脱氮方面的研究鲜见报道。笔者进一步探讨了该菌株异养硝化-好氧反硝化的影响因素，以期为菌株HD-NAH应用于淡水养殖废水的除氮处理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种分离样品。采集于湖南省长沙市东湖养殖场池塘底泥，装于无菌玻璃瓶中，迅速带回实验室进行富集培养和菌株分离。

1.1.2 培养基。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH自然。加入2%琼脂，制成斜面培养基。

反硝化培养基：柠檬酸钠9.0 g/L，NaNO2 0.6 g/L，Na2HPO4 1.0 g/L，NaH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L，1%溴麝香草酚蓝（Bromothymol Blue，BTB）1.0 mL/L，琼脂2%，pH 7.0。基础脱氮培养基：成分同反硝化培养基，不添加1% BTB和琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的富集与初筛。

称取10 g池塘底泥于100 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，32 ℃ 170 r/min摇床中富集培养72 h后，按10倍稀释法将富集液稀释至10-8。分别取最后3个稀释度的稀释液0.1 mL涂布于反硝化固体培养基平板上，32 ℃ 恒温培养箱中培养至长出单菌落后，挑取不同形态的单菌落进行纯化并编号。

1.2.2 菌种复筛。

将分离纯化的菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，32 ℃ 170 r/min条件下振荡培养24 h后，离心收集菌体，使用基础脱氮培养基洗涤菌体2次，等体积基础脱氮培养基悬浮菌体，按1%（V/V）接种量分别接种于基础脱氮培养基中，32 ℃ 170 r/min条件下振荡培养48 h后，测定菌株对亚硝氮（NO2--N）的去除率。

1.2.3 菌种鉴定。参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]，对菌株HD-NAH的菌落和菌体形态进行观察并分析菌株的常规生理生化指标。采用DNA提取试剂盒（SK8257，上海生工生物工程股份有限公司）提取菌株的基因组DNA，通过PCR扩增16S rDNA序列。PCR体系（25 μL）：10×Buffer （Mg2+） 2.5 μL、dNTP 1 μL、Taq酶 0.2 μL、引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′）各0.5 μL、模板0.5 μL，用无菌ddH2O定容至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min。测序后将16S rDNA序列提交至NCBI，使用Blastn检索比对，用MEGA 7.0.26软件的邻位连接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，bootstrap自展1 000次检验。

1.2.4 菌株HD-NAH脱氮特性研究。采用单因素试验法，分别改变基础脱氮培养基的碳源种类（柠檬酸钠、碳酸钠、丁二酸钠、酒石酸钠和蔗糖）、C/N（2、6、10、14、18、22）、初始pH（6、7、8、9、10）、温度（22、27、32、37、42 ℃）、摇床转速（130、150、170、190、210 r/min）和氮源种类（121.74 mg/L NH4Cl、121.74 mg/L NaNO3、121.74 mg/L NaNO2、60.87 mg/L NH4Cl+60.87 mg/L NaNO3、60.87 mg/L NH4Cl+60.87 mg/L NaNO2），探讨不同条件下菌株HD-NAH的脱氮性能。