麻疯树油体钙蛋白JcCale26.8基因克隆及序列分析

摘要 [目的]克隆麻疯树（Jatrapha curcas）油体钙蛋白基因JcCale26.8全长cDNA序列，探究麻疯树油体钙蛋白及其基因的结构与功能。[方法]应用RNA-seq测序和PCR技术，从麻疯树种子中克隆获得1个油体钙蛋白家族基因JcCale26.8，并进行测序和序列分析。[结果]JcCale26.8基因序列含有6个外显子和5个内含子，内含子剪接位点符合真核生物基因的GT-AG法则。JcCale26.8基因mRNA序列的完整开放阅读框长717 bp，推测编码由238个氨基酸组成、相对分子量为26.8 kD的油体钙蛋白JcCale26.8。JcCale26.8蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成，并具有油体钙蛋白典型结构特征，与来自蓖麻、川桑和异色山黄麻等多个不同物种的Caleosin蛋白具有较高的同源相似性。[结论]该研究可为麻疯树油体钙蛋白基因的表达调控与功能研究奠定基础。

关键词 种子;油体;麻疯树;油体钙蛋白;基因克隆

中图分类号 S 794.9  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0086-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.022

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and Sequence Analysis of Caleosin Gene JcCale26.8 in Jatropha curcas

PU Zhi-yu，HUANG Jian-hui，LI Guo-ze et al

（Key Laboratory of Forest Biotechnology in Yunnan，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224）

Abstract [Objective]To clone the full-length cDNA sequence of JcCale26.8 gene from J.curcas and investigate the structure and function of caleosin and its gene in J.curcas seeds.[Method]This study used RNA-sequencing and PCR technology to clone a caleosin family gene JcCale26.8 from J.curcas seeds.Then the sequence of gene JcCale26.8 were sequenced and analyzed.[Result]The DNA sequence of JcCale26.8 gene contains 6 exons and 5 introns.The splicing sites of introns conform to the GT-AG rule of eukaryotic genes.The full-length mRNA comprised 717 bp nucleotides consisting of an open reading frame encoded a putative JcCale26.8 comprising 238 amino acid residues with molecular weight of 26.8 kD.JcCale26.8 protein is mainly composed of α-helix and random coil structure，and has the typical structural characteristics of caleosin.It has high homology and similarity with caleosin proteins from many different species such as Ricinus communis，Morus notabilis and Trema orientalis.[Conclusion]The  study can lay the experimental foundation for the study of the expression regulation and function of caleosin gene in J.curcas.

Key words Seed;Oil body;Jatropha curcas;Caleosin;Gene cloning

油体是脂质（主要是三酰甘油）储存库，主要存在于种子和衰老的叶片中[1]。油体不仅在植物生长发育过程中发挥重要作用，还能参与胁迫响应和激素信号通路等过程[2]。油体由外部完整的磷脂单分子层和围绕着疏水核心的膜蛋白组成[3]，这些膜蛋白包括油质蛋白（Oleosin）、油体钙蛋白（Caleosin）和油体固醇蛋白（Steroleosin）[4]。Oleosin是植物油体特有，且最为丰富的结合蛋白[5-6]，与油体大小和种子萌发率密切相关，并能增强植物种子的抗冻性[4]。Caleosin作为油体上的微量结合蛋白，最早发现于水稻（Oryza sativa）颖果发育时期的细胞膜上[7]，其在植物种子萌发过程中参与脂质降解[8]、油体形成[9]及维持油体的稳定[10]，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）的非种子组织中，Caleosin还表现出过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶活性[11]，参与抵抗逆境胁迫[11]和植物开花调节[12]等过程。

麻疯树（Jatrapha curcas）又名黄肿树（广东）、芙蓉树、假花生（广西）、高桐（云南）、吗哄罕（傣名）、桐油树（台湾）、南洋油桐（日本），为大戟科（Euphorbiaceae）麻疯树属（Jatropha）植物，主要分布于热带和亚热带地区，在我国半野生或栽培种植面积较广，资源丰富[13]。成熟麻疯树种子的含油量高达36%[14]，野生麻疯树种仁的最高含油量约60%，超过油菜和大豆等常见的油料作物[15]，因此开展麻疯树油体结合蛋白及其基因结构与功能研究对于其在油供工业方面的开发利用具有重要意义。而基因克隆与序列分析是开展不同生物目标基因功能研究的前提[16-18]。目前，Oleosin和Caleosin油体结合蛋白基因已经在水稻[7]、芝麻（Sesamum indicum）[9]、油菜（Brassica napus）[19]、拟南芥[20]和蓖麻（Ricinus communis）[21]等不同植物成熟种子中被克隆获得。有关麻疯树中Oleosin及其基因序列和结构特征已有研究[22-24]，但关于麻疯树Caleosin及其基因的研究鲜见报道。笔者以麻疯树种子为材料，应用RNA-seq和PCR技术克隆麻疯树Caleosin基因序列并进行分析，为完善对麻疯树油体膜蛋白的认识及后续解析Caleosin在麻疯树中的基因表达特征和功能发挥奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 试验材料为3年生麻疯树植株发育40 d的麻疯树种子，取自西双版纳热带植物园，液氮速冻后放置于-80 ℃冰箱中保存备用。

RNA提取Trizol试剂和新型快速植物基因组DNA提取试剂盒为OMEGA公司产品，反转录（5 × All-In-One RT MasterMix）和PCR（Kodaq 2 × PCR MasterMix with dye）试剂盒为爱必梦（abm）公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 核酸提取与检测。

将麻疯树种子种壳去除，取种仁于液氮中研磨并用于核酸提取。总RNA的提取按照Trizol试剂使用说明书进行，基因组DNA的提取按照OMEGA公司新型快速植物基因组DNA提取试剂盒使用说明书进行;基因组DNA和总RNA的完整性和纯度分别用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nano Photometer分光光度计（IMPLEN CA USA）检测。

1.2.2 麻疯树种子RNA-seq测序及目标基因挖掘。

检测合格的总RNA样本送至安诺优达基因科技（北京）有限公司，构建文库后利用Illumina平台进行RNA-seq测序，原始下机序列（Raw Reads）通过去低质量序列、去接头污染等过程完成数据处理得到高质量的序列（Clean Reads）。对质控后的高质量序列进行组装，再基于组装序列结果进行ORF及功能预测分析，从RNA-seq数据库中挖掘具有潜在Caleosin功能结构域的目标cDNA序列。

1.2.3 麻疯树JcCale26.8基因cDNA序列克隆验证。

在目标基因cDNA序列ORF区两侧设计特异性引物对F（5′-AGATGGCTACTAGAACGGACG-3′）和R（5′-GCCACCATTGCTTTACATTCT-3′），并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取总RNA样品为模板，按照反转录试剂盒说明书进行第一链cDNA的合成。取反转录产物cDNA 模板2.0 μL，R和F引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，Kodaq 2 PCR MasterMix 12.5 μL，Nuclease-free H2O 9.5 μL，建立25 μL PCR反应体系。PCR反应程序：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃变性30 s，53.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，38个循环，72 ℃延伸10 min。

1.2.4 麻疯树JcCale26.8基因DNA序列克隆。

取“1.2.1”步骤中提取的高质量gDNA样品3 μL为模板，R和F为引物对，进行JcCale26.8基因DNA序列的PCR扩增，反应体系和扩增条件同“1.2.3”。

1.2.5 PCR产物检测回收与克隆测序。步骤“1.2.3”和“1.2.4”中PCR产物采用1.0%琼脂凝胶电泳检测，目的片段回收后与pMD19-T载体连接，转化DH5a感受态细胞，经复苏后涂布在LB固体培养基上（含Amp、IPTG和X-Gal）培养，蓝白斑筛选阳性克隆，委托上海生工生物技术服务有限公司测序。

1.2.6 JcCale26.8基因的生物信息学分析。应用表1显示的网站对JcCale26.8基因及推导编码的蛋白质序列进行对应项目内容的分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取和JcCale26.8基因的cDNA序列克隆分析

植物组织总RNA样品的纯度和完整性是基因克隆等分子生物学试验成功的关键因素[25-26]。该试验获得的发育40 d 麻疯树种子总RNA完整性好，显示28S和18S rRNA条带清晰，点样孔无亮斑，无弥散拖尾，且前者条带的亮度约为后者的2倍（图1）;总RNA的A260/A280比值在1.8～2.0，说明纯度好且无蛋白质、多糖和酚类物质等杂质污染[27]。符合RNA-seq建库测序和基因克隆试验要求。试验构建的麻疯树种子RNA-seq数据库共获得33 902个Unigene，GC含量占40.72%，总碱基数达33 168 384个，从中挖掘获得2条cDNA序列具有潜在Caleosin功能结构域（表2），序列S1和S2均具有完整ORF区域。以具有较长ORF区的序列S1为目标进行克隆验证分析。按“1.2.3”进行RT-PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳结果（图2）显示，在对应DL2000分子量标准的750 bp条带处出现1条符合预期大小的主条带，经胶回收T/A克隆测序，获得与转录组数据库Unigene序列S1引物间完全一致的长738 bp的cDNA序列。长1 026 bp的目标序列S1推导编码分子量为26.8 kD的Caleosin蛋白，因此命名为JcCale26.8基因。该试验获得JcCale26.8基因cDNA序列全长1 026 bp，1～43 bp为5′UTR，761～1 026 bp为3′UTR，位于826～831 bp的一致性序列AATAAA和2个U-rich单元（位于957～964 bp和1 016～1 021 bp处）为预测的PolyA信号位点;44～760 bp为完整ORF，推测编码由238个氨基酸组成的Caleosin蛋白JcCale26.8。

2.2 JcCale26.8基因DNA序列克隆与分析 该试验提取的麻疯树种子基因组DNA完整性好、纯度高。DNA样品条带清晰单一（图3），点样孔无亮斑，无弥散拖尾，其A260/A280值为1.96。以提取的高质量DNA样品为模板，按“1.2.4”进行PCR扩增获得大于2 000 bp的DNA条带（图4），克隆测序结果为2 018 bp的JcCale26.8基因组DNA序列。经DNA和mRNA序列比对分析（图5）显示，JcCale26.8基因含有6个外显子和5个内含子。内含子位于JcCale26.8基因DNA序列116～395、546～1 008、1 095～1 271、1 367～1 464、1 591～1 674 bp，每个内含子序列5′端为GT、3′端为AG，均符合真核生物基因内含子剪接位点的GT-AG规则。