水解驴胎盘提取物对UV诱导皮肤细胞损伤的保护作用

摘要 [目的]探究水解驴胎盘提取物防护光损伤的效果与作用机制，旨在填补水解驴胎盘提取物在防护UV光损伤方面的研究空白，实现驴胎盘的高值化利用。[方法]采用CCK-8方法探究水解驴胎盘提取物对HS68和HaCaT细胞增殖率的影响，利用UVA和UVB分别诱导HS68和HaCaT细胞建立体外光损伤模型，研究水解驴胎盘提取物对UV损伤HS68和HaCaT细胞的保护作用。[结果]0.10%～10.00%（V/V）的水解驴胎盘提取物可显著促进HS68和HaCaT细胞生长;1.00%和0.50%（V/V）水解驴胎盘提取物可显著减弱UVB对HaCaT细胞的损伤，显著减少细胞内ROS的产生和MDA的分泌，显著增加细胞内SOD活性;1.00%（V/V）水解驴胎盘提取物可显著降低UVA辐射HS68细胞造成的MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA表达上升，但不能改善COL Ⅰ和COL Ⅲ mRNA表达的减少。[结论]水解驴胎盘提取物能够防护UVA和UVB造成的皮肤光损伤，可能与提高抗氧化酶活性、降低脂质过氧化程度、抑制金属蛋白酶的异常分泌有关。

关键词 水解驴胎盘提取物;UVA;UVB;皮肤细胞;抗光损伤;保护作用

中图分类号 S 879.9  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0153-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.039

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Protective Effects of Hydrolyzed Donkey Placenta Extract on UV-induced Skin Cells Damage

LIAO Feng1，FAN Yu-mei1，TANG Jie2，3 et al

（1.National Engineering Research Center for Gelatin-based Traditional Chinese Medicine，Dong-E-E-Jiao Co.，Ltd.，Liaocheng，Shandong 252201;2.Cosmetics Safety and Efficacy Evaluation Center，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610041;3.Sichuan Engineering Technology Research Center of Cosmetic，Chengdu，Sichuan 610041）

Abstract [Objective]To explore the effect and mechanism of the hydrolyzed donkey placenta extract in protecting against light damage，aiming to fill the gap in the research of hydrolyzed donkey placental extract in protecting against UV light damage，and realize the high-value utilization of donkey placenta.[Method]The effects of hydrolyzed donkey placenta extract on the proliferation of HS68 and HaCaT cells were studied by CCK-8 method.The photodamage models of HS68 and HaCaT cells induced by UVA and UVB were established.The protective effects of hydrolyzed donkey placenta extract on HS68 and HaCaT cells damaged by UV were studied.[Result]0.10% -10.00%（V/V） of hydrolyzed donkey placenta extract could significantly promote the growth of HS68 and HaCaT cells; 1.00% and 0.50% （V/V） of hydrolyzed donkey placenta extract could significantly attenuate UVB damage to HaCaT cells，significantly reduce intracellular ROS production and MDA secretion，and significantly increase intracellular SOD enzyme activity.1.00% （V/V） of hydrolyzed donkey placenta extract could significantly reduce the increase of MMP-1，MMP-3 and MMP-9 mRNA expression induced by UVA radiation in HS68 cells，but could not improve the decrease of COL Ⅰ and COL Ⅲ mRNA expression.[Conclusion]The hydrolyzed donkey placenta extract can protect the skin from photodamage caused by UVA and UVB，which may be related to increasing the activity of antioxidant enzymes，reducing the degree of lipid peroxidation，and inhibiting the abnormal secretion of metalloproteinases.

Key words Hydrolyzed donkey placenta extract;UVA;UVB;Skin cells;Anti-photodamage;Protective effect

胎盘作为妊娠期母体的临时性器官，富含免疫球蛋白、胶原蛋白、激素、生长因子、细胞因子、氨基酸、糖胺聚糖、酶和微量元素等活性成分[1-2]，这些活性成分与胎盘提取物的生物活性有着密切的关系[3-4]。现代药理研究表明，胎盘提取物具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗皱[7]、抗过敏[8]、改善黑色素代谢异常[9]、改善皮肤干燥和促进胶原合成[10]等作用，已被用于多种皮肤病的治疗且效果明显，包括接触性皮炎[8]、脱发[11]、痤疮瘢痕[12]和伤口愈合[3]等。鉴于胎盘提取物的良好效果，胎盘提取物广泛应用于临床和美容领域。许多国家开发了胎盘提取物相关护肤产品，如护肤霜、乳液等[3]。已有研究证实，口服猪胎盘提取物能够有效改善皮肤干燥、皮肤屏障功能、弹性和皱纹[13-14]。进一步证实，口服猪胎盘提取物[14]和使用猪胎盘提取物凝胶[15]可有效改善中波紫外线（UVB）造成的氧化损伤、经皮失水量的增加与皱纹形成。有研究证实，猪胎盘提取物能够明显提高UVB光损伤角质形成细胞的活性、降低细胞活性氧自由基（ROS）水平、增加超氧化物歧化酶（SOD）的表达[15-16]。然而，长波紫外线（UVA）穿透能力较强，能直达皮肤真皮层，也是导致光老化的主要原因，目前对于胎盘提取物防护UVA的研究较少。因此，胎盘提取物作为护肤产品的抗光损伤效果和作用机制尚未被全面研究。

化妆品中禁止使用人胎盘和牛胎盘，所以猪胎盘、羊胎盘的使用较为广泛。水解驴胎盘提取物作为一种具有开发前景的护肤品原料，相关应用报道较少。而且，目前有关驴的疫病国内外鲜见相关文献报道[17]，可见相比于猪羊，驴胎盘相对安全。因此，笔者利用UVA和UVB分别诱导HS68细胞和HaCaT细胞损伤建立体外光损伤模型，探讨水解驴胎盘提取物（hydrolyzed donkey placenta extract，HDPE）对UV损伤皮肤细胞的保护作用，旨在为水解驴胎盘提取物改善UV造成的光损伤提供了一定的研究基础，填补水解驴胎盘提取物在防护UV光损伤方面的研究空白，实现驴胎盘的高值化利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂。DMEM培养基、胎牛血清（FBS），美国Gibco公司;八肽胆囊收缩素（CCK-8），日本同仁化学研究所;总SOD活性检测试剂盒，南京建成生物研究所;脂质氧化MDA检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司;Trizol RNA提取试剂，赛默飞世尔科技;反转录试剂盒（HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR，+gDNA wiper）、实时荧光定量PCR试剂盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix），南京诺唯赞生物科技有限公司;引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.1.2 试材。永生化人角质形成细胞（HaCaT），中国科学院昆明细胞库;人成纤维细胞（HS68），美国ATCC细胞库;驴胎盘由东阿阿胶股份有限公司提供。

1.1.3 仪器。酶标仪、CFX-connect荧光定量PCR仪，美国Bio-Bad公司;倒置荧光显微镜，日本Olympus公司;ND-2000超微量核酸蛋白测定仪，美国Nano Drop公司;SS-04A型UVA仪、SS-04B型UVB仪，上海适玛公司。

1.2 试验方法

1.2.1 HDPE的制备。取新鲜驴胎盘样品，先用生理盐水冲洗干净，并用手术器械去除筋膜和脐带。然后用自来水清洗数次，直至去除淤血。脱水绞碎后，1∶1加入蒸馏水，再加入MgCl2，加热到70 ℃后保持30 min。经木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解，灭酶后过滤，上清液经0.22 μm滤膜过滤后，即为水解驴胎盘提取物。

1.2.2 HDPE对细胞存活率的影响。HaCaT细胞、HS68细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养。将培养皿中生长至80%左右的HaCaT细胞、HS68细胞回收至离心管中，通过细胞计数仪计数，按照2.0×104～8.0×104 cells/孔接种至24孔细胞培养板中，培养24 h。试验分为HDPE处理组（25.00%、10.00%、1.00%、0.10%、0.01%，V/V）和空白对照组。在37 ℃培养箱中继续培养24 h。培养板内加入适量CCK-8 后培养4 h，测定450 nm吸光度，计算细胞在HDPE各体积分数作用下的存活率。

1.2.3 细胞分组处理。培养皿中生长至80%左右的HaCaT细胞，按照3.0×105～4.0×105 cells/孔接种至6孔细胞培养板中，培养24 h。试验分为空白对照组、模型对照组和HDPE处理组（1.00%、0.50%和0.10%，V/V）。根据试验分组设定，分别将配制好的待测物添加至HaCaT细胞内，在37 ℃培养箱中培养过夜24 h。倒掉培养液，每孔添加2 mL磷酸盐缓冲液（PBS），放置于UVB辐照仪下，辐照能量30 mJ/cm2。空白对照组不照射UVB。弃去PBS，换成不含血清的培养基，培养6 h后，Trizol处理细胞并收集细胞用于mRNA表达检测。

将融合至约80%的HS68细胞按照3.0×105～4.0×105 cells/孔接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h。弃培养基，加入PBS，经5 J/cm2 UVA辐射后，分为UVA对照组（加DMEM培养基）和HDPE处理组（1.00%、0.50%、0.10%，V/V）。培养6 h后，Trizol处理细胞并收集细胞用于mRNA表达检测。