一株稻田固氮蓝藻的分离鉴定及其镉耐受和去除能力评估

摘要  通过分离固氮蓝藻藻株获得单种培养，综合采用多种抗生素、放线菌酮和紫外线照射等处理，得到纯化藻株。采用16S rDNA和rbcLX同源性分析进行藻株鉴定，并对藻株的Cd耐受能力和去除能力进行评估。结果表明，藻株最终可鉴定为Nostoc sp.，其对Cd的去除率在24 h达到最高（33.79%），说明该藻对Cd的去除能力相对较弱。Cd对该藻的半致死抑制浓度为0.205 mg/L，属于高毒性。此外，在Cd的胁迫下藻的C—H、C= =O和—NH2等基团吸收发生改变。

关键词  固氮蓝藻;纯化;分离;鉴定;镉;耐受能力;去除能力

中图分类号  X 171.4   文献标识码  A    文章编号  0517-6611（2022）15-0051-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2022.15.014

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and Identification of a Nitrogen-fixing Cyanobacteria in Paddy Field and Evaluation of Its Cadmium Tolerance and Removal Ability

ZHANG Ding-huang1， ZHU Di2， LI Yong-jun3 et al

（1.Zhongshan Agricultural Products Quality and Safety Inspection Institute， Zhongshan， Guangdong 528400;2.College of Natural Resources and Environment， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510000;3.Qingyuan Polytechnic， Qingyuan， Guangdong 511500）

Abstract  The monoculture was obtained by isolating nitrogen-fixing cyanobacterial strains， and a variety of antibiotics， cycloheximide and ultraviolet irradiation were comprehensively used to obtain purified algal strains.The 16S rDNA and rbcLX homology analysis was used to identify the algal strains， and the Cd tolerance and removal abilities of the algal strains were evaluated.The results showed that the algal strain could be finally identified as Nostoc sp.， and its removal rate of Cd reached the highest （33.79%） at 24 h， indicating that the algae had a relatively weak ability to remove Cd.The half-lethal inhibitory concentration of Cd against the algae was 0.205 mg/L， which was highly toxic.In addition， the absorption of C-H， C=O and -NH2 groups in algae changed under the stress of Cd.

Key words  Nitrogen-fixing cyanobacteria;Purification;Isolation;Identification;Cadmium;Tolerance;Removal ability

镉（Cd）污染治理是当前国家的重大需求，国内外研究表明微藻可能在Cd污染水体处理方面具有很大潜力[1]。固氮蓝藻是热带亚热带地区重要的微生物资源，自从1889年Franck发现了固氮蓝藻，到20世纪末期已得出20多个属的150多种蓝藻具有固氮能力[2]。我国记载了800多种蓝藻，其中有固氮能力的就有70多种[3]。且我国很早就有将固氮藻类中的葛仙米和发菜等作为食品和药物使用的记载，已经成了价格高昂的保健食品。研究表明稻田中接种固氮蓝藻可显著增产，如在湖北晚稻田中测得其固氮量为22.5～37.5 kg/hm2[4]。随全球变暖和水体富营养化日益严重，固氮蓝藻的农业应用和生态价值将日益凸显。同时，研究表明固氮蓝藻在生物活性物质发掘、新能源开发、功能食品研制和环境保护等方面均具有重要的应用前景[5]。固氮蓝藻蛋白质含量高，氨基酸组成完全，含有丰富的维生素和微量元素，在生长繁殖过程中还可分泌出少量的氨基酸、激素等活性物质促进作物生长[6]。固氮蓝藻还可以用于环境污染修复，并已有利用藻菌结合体清除石油污染的报道[7]。一些固氮蓝藻可以用于水体营养物质和重金属的去除[8]。同时，固氮蓝藻还具有修复水体农药和染料等污染的潜力[9]。已有很多利用筛选到的固氮蓝藻结合固定化技术进行了应用技术方面的探索。另外，在我国西北地区丝状固氮蓝藻已被用于荒漠和盐碱化土壤治理中，并获得了不错的效果。

国内已有对湖北、湖南、江西、北京、延边、西北荒漠区等地的固氮蓝藻资源的调查研究，并分离纯化了不少固氮藻株，但关于广东、广西、海南等省份固氮蓝藻的研究非常少[10]。现在中国科学院武汉水生生物研究所藻种库保存的藻种主要来自湖北、湖南和江西等亚热带地区，可以预见属热带、亚热带的海南、广东、广西部分地区必定有不少的固氮蓝藻种质资源待发掘，甚至可能会有某些特殊功能的种类存在。

笔者从中山实验田采集土样、水样，然后经过紫外线法、抗生素法将其纯化为单一藻株，鉴定出藻种为念珠藻，通过重金属Cd对念珠藻的急性试验，评估Cd对念珠藻的生态毒理效应，研究其对镉的耐受能力和去除能力。

1 材料与方法

1.1 培养基和化学药品

试验所用固氮蓝藻培养基为无氮BG11（BG110）。除培养基以外，所用的药品还包括乙醇、（1+1）盐酸溶液、邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二钠、硼砂、氯化钾、pH=4.01 标准缓冲溶液、pH=6.87 标准缓冲溶液、pH=9.18标准缓冲溶液、20 mg/L的镉溶液。

1.2 试验仪器

100 mL锥形瓶、50 mL锥形瓶、分光光度计、TOC 分析仪、往复式振荡器、磁力搅拌仪、光照培养箱、微孔滤膜、离心管、试管、烧杯、滴管、移液枪（20 μL、200 μL、1 000 μL、5 mL）、电子天平、4 ℃冰箱、-40 ℃冰箱、比色皿、各种规格培养皿、酒精灯、接种环、高压灭菌锅、带相机和视频摄像头的Olympus倒置显微镜、低温高速离心机、冻干机、超净工作台、抽滤装置、纯水机、酸度计。

1.3 藻株分离和纯化

1.3.1    藻的富集培养。

将从中山实验田采集回来的土样、水样取少量放入100 mL锥形瓶中，分别加入40 mL无氮BG11培养基放在恒温培养箱中进行富集培养，培养条件为温度（27±1）℃、光照（2 700±50）lx、光暗比16 h ∶8 h。

1.3.2    藻株分离。

培养20 d后，将富集培养的藻样用移液器移取20～50 μL涂布于含BG110的琼脂固体平板上。等长出肉眼可见的藻后，用接种环小心挑取，在新的固体培养基上Z字形划线转接，重复此操作直到纯化出单一藻种为止。分离方法：在超净工作台内，将接种环在酒精灯上灼烧，接种环除菌后蘸取少许待纯化藻类，在无菌BG110固体培养基表面进行平行划线、扇形划线或Z字划线的连续划线，用无菌的Parafilm对培养皿进行封口，放在培养箱中倒置培养，用以分离出单个菌落。待长出单个菌落后，在显微镜下观察藻的形态、细胞结构，看是否为单一藻株，若不是单一藻株，再采用相同的方法或者毛细管分离法、梯度稀释法进行分离，直至找到单一藻株。

1.3.3    藻种纯化。

用抗生素、抗菌酮等处理，除菌、纯化藻株，具体步骤为先分别在5个50 mL 锥形瓶中加入BG110培养液 20 mL，经过高压蒸汽灭菌后，冷却，在超净工作台接种2 mL藻株在50 mL锥形瓶中;同时配制氨苄青霉素、硫酸庆大霉素、卡那霉素、链霉素4 种抗生素的混合浓缩液共10 mL，浓度均为 2 g/L，在超净工作台中用无菌的一次性过滤头和针筒过滤混合液，装在预先灭菌的玻璃锥形瓶中;然后分别取2 g/L的混合抗生素母液10、8、6、4、2 μL加至上述含BG110培养液20 mL的5个50 mL锥形瓶中，处理 3 d。3 d后离心机15 ℃、7 000 r/min离心7 min，弃去上清液，随后沉淀用无菌水离心清洗3 次，划平板，用封口膜封口，放入培养箱中培养。重复上述操作直至通过显微镜观察不到明显的菌生长。藻株的保存采用固体培养基斜面或平板保种（常温或低温）和液体培养基保种相结合的方法。

1.3.4    藻株的扩大培养。

在1个 50 mL锥形瓶中加入BG110培养液20 mL，经过高压蒸汽灭菌后，冷却，在超净工作台中用接种环从分离纯化后的固氮蓝藻培养皿中刮取少量藻株接种到上述锥形瓶中，确保要刮取到藻，然后放培养箱中培养，每天定时摇瓶4～6 次。

1.4 固氮蓝藻鉴定

采用分子生物学方法对蓝藻进行鉴定，通过选择有代表性的基因序列片段作为分类标准来区分不同生物、同种生物种内株系之间的遗传差异，此方法操作容易、结果可靠。

将筛选出来的优良藻株用16S rDNA序列分析法进行鉴定，即用一对引物27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）和 1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增，通过测序确定16S rDNA序列，再通过 Genebank 进行 Blast 比较分析确定藻株所属的属。在此基础上，用两对引物CX（5′-GGCGCAGGTAAGAAAGGGTTTCGTA-3′）、CW（5′-CGTAGCTTCCGGTGGTATCCAC GT-3′）对固氮蓝藻基因rbcLX进行扩增和测序。通过 Blast比较分析进行藻种鉴定。

1.5 藻对Cd耐受能力评估试验

取8个50 mL锥形瓶，每个瓶中装20 mL的BG110培养基。向锥形瓶中加入不同体积Cd母液（20 mg/L），使瓶中Cd最终浓度分别为0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600和0.800 mg/L。每个瓶中再加入2 mL培养到对数生长期的藻种液。培养4 d后在超净工作台取3 mL均匀藻液测OD680值，并观察藻细胞的变化。

1.6 藻对Cd的去除效果试验