一株高效烟碱降解菌的筛选及其在烟草烘烤中的应用

摘要 在湖北恩施的连作土壤中分离出一种能够高效降解烟碱的细菌P3a，从形态结构特征、16S rDNA序列分析以及建构系统发育树等方面对其进行鉴定，结果表明P3a为节杆菌（Arthrobacter sp.）。该菌株能在pH 7.0、温度37  ℃、230 r/min的条件下，36 h内对2 g/L烟碱的降解率为99.06%。并将菌株P3a应用到新鲜的烟叶中，发现它可以减少1 kg新鲜烟叶中55.11%的烟碱。鉴于其对烟碱的降解能力很强，可高效地应用于环境和烟草废弃物中烟碱降解。

关键词 烟碱降解菌;筛选;鉴定;高效液相色谱法;烟草烘烤;应用

中图分类号 TS 41+4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）16-0045-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.16.013

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of a Highly Effective Nicotine-degrading Bacterium and Its Application in Tobacco Baking

GUO Qing-qing1，XU Tian-chi1，YANG Chun-lei2 et al

（1.College of Life Sciences，Hubei University，Wuhan，Hubei 430062;2.Hubei Provincial Tobacco Research Institute，Wuhan，Hubei 430030）

Abstract Bacteria P3a was isolated from continuous cropping soil in Enshi of Hubei Province，and identified from morphological and structural characteristics，16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree construction.The results showed that P3a was Arthrobacter sp..At pH 7.0，temperature 37  ℃ and 230 r/min，the degradation rate of 2 g/L nicotine was 99.06% within 36 hours.When the strain P3a was applied to fresh tobacco leaves，it was found that it could reduce nicotine by 55.11% in one kilogram of fresh tobacco leaves.In view of its strong ability of nicotine degradation，it could be effectively applied to nicotine degradation in the environment and tobacco waste.

Key words Nicotine-degrading bacteria;Screening;Identification;High performance liquid chromatography;Tobacco baking;Application

烟碱又名尼古丁，分子式C 10H 14N 2，是烟草中的主要生物碱，是烟草和卷烟质量评价的重要因素。烟碱是吸烟成瘾的关键成分，且对人体也有一定程度的损伤。如高淑芳等[1]研究表明，烟碱可以轻易穿过血脑屏障和生物膜对人体造成影响，尤其是当妇女处在妊娠期时，会导致新生儿易患病，神经和智力发育也会受阻。同时，随着烟草制品的大量生产和消费，包括烟碱、氨基联苯、萘胺、苯并（a）芘等有毒物质在内的烟草废弃物进入了环境，这些有害物质无法回收利用，已经产生严重的环境问题[2-3]。当烟碱含量超过0.05%（W/W）时，这些废物被欧盟规定为有毒有害物质[4]。如果处理不当，这些废物可能损害人类健康和环境。数据显示，生产1 t卷烟需要排放60 t以上烟草废水[5]，且我国烟草制品中普遍存在烟碱含量过高的问题，因此对于环境和烟草制品中的烟碱降解是非常有必要的。

目前对于烟碱的降解主要集中在生物处理方面，与物理、化学处理方法相比，微生物降解菌在成本、效率和可持续性方面都具有优势[6]。在生物降解烟碱的方法中，主要报道的烟碱降解菌多属于假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Acetobacter）、苍白杆菌属（PaleBacillus）、农杆菌属（Agrobacterium）[7-8]。Wang等[9]从烟草根际土壤中分离出一种高效降解的菌株Agrobacterium sp.strain S33，它能在最优的培养条件下将1 g/L烟碱在6 h内完全降解;张娟[10]从湖南省的烟草土壤中筛得菌株Pseudomonas marginalis.ND，可在2 d内将1 g/L液体培养基中的烟碱降解70.40%。截至目前，有关烟碱降解菌的研究工作尚处于筛选过程，较少地应用到烟草制品及废弃物的降解上。该研究从湖北恩施多年连作的烟田中分离得到一株能够高效降解烟碱的菌株，并对菌株的降解能力进行测定，优化其培养环境，并尝试应用于烟草烘烤过程中，其研究成果不仅可以丰富降解菌株资源，并为降解菌应用于烟草实际生产中提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤来源。筛选高效烟碱降解菌的土壤样本来自湖北恩施的烟草种植区。

1.1.2 培养基。LB培养基：每1 000 mL蒸馏水加NaCl 10 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g，pH为7.0，于115  ℃灭菌20 min。基础盐培养基（MSM）：每1 000 mL蒸馏水加（NH 4） 2SO 4 2 g、MgSO 4 0.2 g、CaCl 2·H 2O 0.01 g、FeSO 4 0.001 g、Na 2HPO 4·12H 2O 1.5 g、KH 2PO 4 1.5 g，pH为7.0，于115  ℃灭菌20 min。

1.1.3 试剂。烟碱标准品（HPLC>99%），购自安徽酷尔生物工程有限公司;甲醇色谱级（质量分数≥99%），购自阿拉丁公司;其他试剂均为AR级试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 降解菌的筛选。

将收集的土壤分别取10 g，放于90 mL灭菌去离子水中，180 r/min振荡过夜获得菌悬液。吸取10 mL的菌悬液接种到烟碱浓度为1 g/L的LB液体培养基中，温度37 ℃，230 r/min培养3 d后再吸取菌悬液100 μL进行第二次驯化，如此循环3次，参考文献[11]进行驯化。从终浓度的培养基中吸取菌悬液100 μL接种到烟碱浓度为1 g/L的基础盐培养基中，温度37 ℃，230 r/min培养2 d后，随后吸取菌悬液100 μL接种到烟碱浓度为2 g/L的基础盐培养基中，温度37 ℃，230 r/min培养2 d，依次传代接种至烟碱浓度为5 g/L的基础盐培养基，取最后一次的菌悬液100 μL 涂布LB固体培养基中，反复纯化多次分离，挑选形态鲜明、菌落清晰的不同单菌落。将不同形态特征的单菌落采用甘油保存方式，保存于-80 ℃的超低温冰箱中，备后续试验所用。

1.2.2 菌种鉴定。形态结构观察及生理生化试验参照文献《常见细菌系统鉴定手册》进行。

分子生物学鉴定：通过DNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）得到目标菌株的基因组，进行PCR扩增。反应体系：DNA模板5 μL，正反向引物各1 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，10×Extaq buffer 5 μL，Extaq 1 μL，加ddH 2O补足体系至50 μL。引物序列：27F（5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）;扩增程序：94 ℃预变形3 min;94 ℃变形1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min;30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存30 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小为1 450 bp左右，并与GenBank中的16S rRNA序列进行比对。

1.2.3 培养条件对菌株降解能力的影响。

在LB固体培养基平板上进行降解菌株的活化，并转移到LB液体培养基中作为种子液，检测单因子条件下降解菌株降解能力。

①温度的影响。将降解菌种子液以2%的接种量接种到以烟碱为唯一碳源的MSM培养基中，烟碱的浓度为2 g/L，pH为7.0，不同温度（28、37、45 ℃），230 r/min培养36 h，每12 h取样一次，利用HPLC检测其降解情况。②初始pH的影响。将降解菌种子液以2%的接种量接种到以烟碱为唯一碳源的MSM培养基中，烟碱的浓度为2 g/L，不同pH（5.5、6.0、6.5、7.0、8.0）下，温度37 ℃，230 r/min培养36 h，每12 h取样一次，利用HPLC检测其降解情况。③接种量的影响。将降解菌种子液以不同接种量（1%、2%、3%、4%）接种到以烟碱为唯一碳源的MSM培养基中，烟碱的浓度为2 g/L，pH为7.0，温度37 ℃，230 r/min培养36 h，每12 h取样一次，利用HPLC检测其降解情况，降解率=（CK组峰面积-降解菌组峰面积）/CK组峰面积×100%。

1.2.4 培养条件对菌株生长的影响。

探究影响菌株生长的碳源（葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、可溶性淀粉和麦芽糖）、氮源（蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、牛肉膏和玉米浆干粉）和无机氮源（醋酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵和硝酸钠）对降解菌株的生长影响;将降解菌种子液以2%的接种量接种到以烟碱为唯一碳源的MSM培养基中，烟碱的初始浓度为2 g/L，pH为7.0，温度37 ℃，230 r/min培养12 h，每2 h取样一次，用紫外分光光度计测定600 nm处的OD值，共6次。在MSM培养基中分别加入1、2、3、4、5、6 g/L烟碱，菌株P3a接种量为2%，每12 h采集一次，共5次，同样用紫外可见分光光度计测定600 nm处的OD值。

1.2.5 烟叶烘烤过程中降解菌的降解能力。

在烟叶固化前，利用降解菌株降低烟碱含量。利用优化后的培养基培养菌株24 h，将发酵液离心浓缩蒸馏至浓度为5×109 CFU/mL。最后，对每1 kg新鲜烟叶喷洒100 mL的细菌溶液，而对照组的蒸馏水用量相同。采用GB/T 23225—2008分光光度法测定烟叶烟气固化后的烟碱含量。

1.2.6 菌株生物量的测定。

用紫外分光光度计测定600 nm处OD值，则为菌株的生物量。有效检测范围为0～0.8，如果数值超过该范围，则需要进行样品稀释。

1.2.7 菌株降解率的检测。

所有样品的烟碱浓度均采用C 18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱检测（HPLC）。流动相为甲醇∶ 1 mmol/L硫酸=25∶75;流速0.6 mL/min;注入量20 μL;波长259 nm;温度30 ℃。发酵液每6 h取样一次，12 000 r/min离心10 min。然后在4 ℃处沉积取上清液。发酵过程完成后，用0.05 mol/L盐酸稀释20倍，最后用0.22 μm的滤膜过滤，用HPLC测定。