烟草黑胫病菌胶体金免疫层析快速检测技术的建立与评价

摘要 以烟草黑胫病为研究对象旨在开发一种快速、简单、灵敏的胶体金免疫层析快速检测技术。制备了一种抗烟草黑胫病菌单克隆抗体，并将其应用于胶体金免疫层析试纸研制;在5～10 min就可以检测到病原菌，检测极限为0.1 μg/mL抗原。烟草黑胫病菌胶体金免疫层析快速检测技术与常规PCR技术相比，胶体金速测卡检出率略低于常规PCR检测。

关键词 烟草黑胫病菌;胶体金免疫层析;快速检测

中图分类号 S 435.72  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）17-0128-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.17.032

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Development and Evaluation of Colloidal Gold Immunochromatography Technique for Rapid Detection of  Phytophthora nicotianae

YANG  Yang1， YANG  Guo-gen2， YANG  Yi-de1 et al

（1.Yibin Company of Sichuan Tobacco Company， Yibin，Sichuan 644600;2. School of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei，Anhui  230036）

Abstract The purpose of this study was to develop a rapid， simple and sensitive colloidal gold immunochromatographic technique for the rapid detection of tobacco black shank. In this study， a monoclonal antibody against tobacco black shank pathogen was prepared and applied to immunochromatographic test paper;pathogen can be detected within 5-10 minutes， and the detection limit was 0.1 μg/mL antigen. Compared with PCR， the detection rate of colloidal gold rapid detection card was slightly lower than PCR.

Key words  Phytophthora nicotianae ;Colloidal gold immunochromatography;Rapid detection

由烟草疫霉（ Phytophthora nicotianae ）引起的烟草黑胫病是烟草生产上最主要的病害之一，主要危害烟草的茎基部和根，严重时导致植株死亡[1]。我国各烟区除黑龙江外均有发生，其中西南烟叶产区发病较重，每年因烟草黑胫病引起的经济损失超过1.2亿元[2]。近年来，烟草黑胫病发病率有加重趋势，烟草黑胫病的控制主要依赖于化学防治，长期过量使用化学杀菌剂，导致农药残留量超标和抗药性菌株产生[3-4]。因此，推广烟草黑胫病的绿色防控技术，减少化学农药使用量，保障烟叶绿色安全生产，烟草黑胫病的快速诊断是关键[5]。

烟草黑胫病的传统检测依赖于病原菌的分离和田间症状观察，而随着分子生物学技术的快速发展，相继出现了基于核酸的检测体系，如常规PCR、多重PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等，提高了烟草黑胫病的诊断效率[6-9]。胶体金免疫层析技术是1990年由Beggs等[10]建立的一种用来检测人尿和血清中HCG的技术，胶体金免疫层析技术具有操作简单、检测时间短、特异性强等特点，且不需要特殊仪器设备。目前，胶体金免疫层析技术被广泛应用于食品安全、动物传染病、人畜共患病、植物病害、农药残留和重金属离子等方面的快速检测[11-14]。利用胶体金免疫层析试纸条能够快速、准确检测茶叶中草甘膦含量[15];以金黄色葡萄球菌菌体抗原免疫家兔获得多克隆抗血清，胶体金免疫层析技术可以快速检测金黄色葡萄球菌[16]。利用马铃薯X病毒（PVX）和马铃薯Y病毒（PVY）的兔多克隆抗体，研制的胶体金试纸条可用于PVX和PVY的快速检测，且灵敏度高、无交叉反应[17]。

为建立高效、准确、便携的烟草黑胫病菌现场检测技术，笔者以烟草黑胫病菌为抗原制备单克隆抗体，以胶体金为标记材料研制胶体金免疫层析检测卡，用于烟草黑胫病菌的现场检测，旨在建立免疫胶体金层析检测技术，可实现烟草黑胫病菌早期诊断和病害监测，对烟草黑胫病的早期预防具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：烟草疫霉（ Phytophthora nicotianae ），安徽农业大学植物保护学院保存。

供试土样：四川省宜宾市烤烟产区健康烟草根际土壤、烟草黑胫病病株根际土壤，每份约50 g，放入无菌样品袋，于4 ℃保存备用。

10%V8 培养基：取去离子水800 mL，分别加入100 mL V8 汁，CaCO 3 0.2 g，琼脂粉15 g，定容至1 L。

试剂及仪器：牛血清白蛋白BSA、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;其他试剂均为国产分析纯。ST3100型pH计，奥豪斯仪器（上海）有限公司;恒温培养振荡器ZWY-2102C，上海智城分析仪器制造有限公司;台式划膜喷金机HGS510，杭州峰航科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单克隆抗体的制备。

取6周龄雌性BALB/c小鼠4只进行免疫，共进行3次免疫，采取皮下多点注射，其中抗原免疫用量为25 μg。初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，腹腔注射。第二次免疫后10 d尾静脉采血，通过间接法测定抗体效价。

采用有限稀释法将细胞悬液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞，转移至96孔板培养，经过数次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将获得的阳性杂交瘤细胞在细胞培养瓶中扩大培养，而后冻存及制备腹水等。

将腹水离心15 min（4 000 r/min，室温），取上清，在4 ℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30 min，离心30 min（13 000 r/min，4 ℃），弃上清;沉淀溶于适量PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）;在4 ℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30 min，离心30 min（13 000 r/min，4 ℃），弃上清;沉淀溶于适量PBS（0.01 mol/L，pH 7.4），4 ℃透析过夜，测定抗体含量，-20 ℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5 mL超纯水过柱，再用5 mL 0.4 mol/L PB缓冲液（pH 7.0）平衡纯化小柱;抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好地结合在结合位点上;继续10 mL 0.4 mol/L PB缓冲液（pH 7.0）平衡纯化小柱;5 mL 0.1 mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

1.2.2 抗体配对筛选。

配对筛选应用双抗夹心的ELISA方法对制备得到的抗体进行筛选，筛选出可以配对的抗体对。

双抗夹心的ELISA：用包膜缓冲液将包被抗体稀释至10 μg/mL，每孔100 μL，37 ℃包被3 h;洗板3～5次，每孔100 μL，25 ℃反应45 min;洗板3～5次，加入酶标抗体，每孔100 μL，25 ℃反应45 min;洗板3～5次，加入显色剂，25 ℃避光反应15 min;加入100 μL终止液，测定OD 450。

单抗与单抗配对筛选：将单抗作为包被抗体，另一个单抗标记HRP之后作为检测抗体，应用双抗夹心的ELISA方法进行配对筛选。

抗体标记HRP：2 mg HRP溶于纯水，加入高碘酸钠，室温反应30 min;将5 mg抗体用偶联缓冲液透析过夜;将HRP加入抗体溶液中，室温反应2 h;加入硼氢化钠封闭反应位点;磷酸盐缓冲液透析过夜，加入等量甘油保存于-20 ℃。

1.2.3 胶体金试纸的制备。

1.2.3.1 胶体金制备。

取超纯水于烧杯中，加入烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮7～10 min，自然冷却至室温，加超纯水定容。倒入棕色瓶，4 ℃避光保存。

1.2.3.2 胶体金标记抗体。

取1.5 mL胶体金，用0.1 mol/L的K 2CO 3调节pH，加入相应量抗体，混合均匀，室温反应40 min。加入10%的BSA终止反应，静置30 min。1 500 r/min离心，弃凝聚的金胶粒形成的沉淀，8 500 r/min离心30 min，弃上清，沉淀物用金标液复溶，4 ℃保存。

1.2.3.3 喷金与划膜。

将包被抗原稀释至适当浓度划于T线，羊抗鼠二抗划于C线，烘干待用;标记好的胶体金喷于预处理过的金标垫，烘干待用。

1.2.3.4 组装与测试。

按图1所示将速测试纸各个组分组装，并检测配对效果，不用编号的金标垫与膜两两组合，检测配对效果。

1.2.4 试纸条灵敏度检测。

将烟草黑胫病菌菌丝分别稀释为10、100、1 000倍的溶液，分别用试纸条进行检测，每个处理重复3次。

1.2.5 田间样品测试。

将从四川省宜宾市采集的烟草样本利用胶体金测速卡进行检测。

1.2.6 烟草黑胫病菌胶体金速测卡定量检测体系。

将阳性样品（10 μg/mL）梯度稀释后用金标速测卡进行检测，同时用呈色分析仪读取C、T线深度值，重复3组，计算T/C的平均值，建立线性回归方程。

2 结果与分析

2.1 烟草黑胫病菌单克隆抗体制备

以烟草疫霉的菌丝和孢子作为抗原，小鼠经4次免疫后，共获得24个细胞株，纯化后的抗体亚型主要为IgG 其中单抗15和单抗24的抗体亚型为IgM;有22个抗体的效价达1∶128 000及以上，而单抗1和单抗15效价较低为1∶64 000。表明烟草黑胫病菌的单克隆抗体已制备成功，可用于后续抗体配对及胶体金免疫层析速测卡的研制（表1）。

2.2 金标抗体配对筛选

选择13个烟草黑胫病菌的单克隆抗体进行抗体两两配对筛选，判断能否形成稳定的双抗体夹心结构。抗体配对筛选结果表明，金标单抗6配对划膜单抗18，金标单抗16配对划膜单抗14和18，金标单抗19配对划膜单抗18，金标单抗22配对划膜单抗12和单抗18均有明显的阳性反应（较强阳性和强阳性反应），筛选出能够形成稳定的双抗体夹心结构的抗体配对，可用于胶体金免疫层析试纸条的研制（表2和图2）。