菌酶协同发酵对中草药有效成分消化溶出率的影响

摘要 为提高中草药原料在动物生产中的利用效果，以产气荚膜梭菌ATCC13142作为指示菌，从安佑微生物研究所微生物实验室菌种库保存的7株酵母菌（编号J1～J7）中筛选杀菌效果较好的酵母菌，将王不留行、益母草和甘草按4∶3∶3混合作为发酵原料，添加玉米粉作为辅料，筛选出效果较好的纤维素酶，与木聚糖酶共用，评估发酵前后中草药有效成分体外消化溶出率的变化。结果表明，酿酒酵母J3的杀菌效果最佳，纤维素酶M3降解中性洗涤纤维（NDF）效果较好，降解率为10.01%，发酵原料含水量为40%，植物乳杆菌和酿酒酵母J3分别接种1.0×106和1.0×105 CFU/g，纤维素酶M3和木聚糖酶的添加量分别为2 000和3 000 U/kg，37 ℃发酵5 d后，王不留行黄酮苷体外消化溶出率由94.55%提升至95.66%。菌酶协同发酵有助于中草药有效成分消化溶出。

关键词 中草药;有效成分;体外消化;溶出率;菌酶协同发酵

中图分类号 S 816.6  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）17-0150-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.17.037

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Microbial Fermentation with Enzymes on Dissolution Rate of Active Components in Chinese Herbal Medicine  in vitro  Digestion

SHI Bao-lu，WANG Zi-xu，HU Dan-dan et al

（Anyou Biotechnology Group Co.， Ltd.， Taicang，Jiangsu 215437）

Abstract In order to improve the utilization effect of Chinese herbal medicine raw materials in animal production. One strain with better sterilization was screened from 7 conserved yeast strains （number J1～J7） in Anyou Institute of Microbiology Microbiology Laboratory by using  Clostridium perfringens  ATCC13142 as indicator bacteria. The mixture of  Vaccariae Semen， Leonurus japonicas  and  Liquorice  at 4∶3∶3 was used as fermentation materials， and corn flour was added as auxiliary material. One better cellulase product was screened out and shared with xylanase to evaluate the changes of active components in Chinese Herbal Medicine  in vitro  digestion after fermentation. The results showed that  Saccharomyces Cerevisiae  J3 was the most effective bactericidal strain. The cellulase M3 had the best degradation effect on NDF， and the degradation rate was 10.01%. The water content of raw materials was 40%，  Lactobacillus plantarum  and  Saccharomyces Cerevisiae  J3 were inoculated with 1.0×106 and 1.0×105 CFU/g， respectively， and the addition levels of cellulase M3 and xylanase were 2 000 and 3 000 U/kg， respectively. After fermentation at 37 ℃ for 5 days，the dissolution rate of  vaccarin  was increased from 94.55% to 95.66%  in vitro  digestion. Microbial fermentation with enzymes could effectively improve the dissolution rate of active components in Chinese herbal medicine  in vitro  digestion.

Key words Chinese herbal medicine; Active component; In vitro  digestion;Dissolution rate;Microbial fermentation with enzyme

我国拥有丰富的中草药资源和几千年的用药历史经验。中草药作为天然传统药物，富含多种活性物质，具有绿色、安全、低残留等特点，在畜牧业中被应用于养殖动物增强免疫、疾病防治和医药保健[1-2]。中草药有效成分多分布于植物细胞内和细胞间隙，新鲜药材经干燥后，细胞逐渐萎缩，活性物质呈结晶或无定形状态沉积于细胞内，细胞质膜的半透性丧失，导致胞内物质溶出障碍[3]。植物细胞壁主要是由纤维素、半纤维素、果胶质等大分子构成，而常见的超声波萃取技术、超临界流体萃取技术、酶提取技术等中草药提取技术均是通过破坏植物细胞壁，让中草药有效成分与溶剂接触并溶出提取的过程[4]。发酵中药的本质是利用微生物生长代谢过程中产生的酶类消化植物细胞壁，释放活性物质，提高药效，降低药物副作用，产生新的生物活性物质，达到中草药与益生菌协同增效的效果[1]。

王不留行为石竹科植物麦蓝菜[ Vaccaria segetalis （Neck.）Garcke]的干燥成熟种子，具有行血通经、催生下乳、消肿敛疮的功效;益母草为唇形科植物益母草（ Leonurus japonicas  Houtt.）的新鲜或干燥地上部分，具有活血调经、利水消肿、清热解毒的功效;甘草为豆科多年生草本植物，具有补气、止咳、清热解毒、止痛等功效[5]。日粮中添加王不留行可以提高哺乳母猪泌乳性能和抗氧化能力[6-7];益母草和甘草在母猪繁殖性能方面发挥有益作用[8-9]。有研究发现，中草药经益生菌发酵后有效活性成分含量增加[10];刘洋等[11]研究发现，王不留行和益母草经乳酸菌和酵母菌发酵后，可溶性总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷含量分别比未发酵组提高了55.14%、127.28%、55.42%和49.21%。目前，在生物酶法辅助提取中药方面，研究较多的是非淀粉多糖酶，尤其是纤维素酶[3]。前人对发酵中草药成分含量变化的研究，多使用有机溶剂萃取发酵前后的中草药样品，检测活性成分含量，但此方式并不能代表其活性成分的消化溶出效果。该研究通过筛选益生菌和纤维素酶并进行仿生消化处理，评估菌酶协同发酵对中草药有效成分消化溶出率的影响，为发酵中草药应用于母猪生产提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂。

氯化钠、氯化钾、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠、胃蛋白酶（sigma，P7000）、淀粉酶（Sigma，A3306）、胰蛋白酶（Amersco，0785）、糜蛋白酶（Amersco，0164）;王不留行黄酮苷标准品（批号111853-201704，含量96.9%，购自中国食品药品检定研究院）;甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.1.2 菌种。

植物乳杆菌（ Lactobacillus plantarum ）、产气荚膜梭菌ATCC1314 均为安佑微生物研究所微生物实验室甘油管保存。

酵母菌：安佑微生物研究所菌种库酿酒酵母菌7株，编号分别为J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7，均为安佑微生物研究所微生物实验室甘油管保存。

非淀粉多糖酶：木聚糖酶，10万U/g，购自武汉新华扬生物股份有限公司;纤维素酶M1、M2、M3和M4，均选购自市场。

1.1.3 原料。

玉米粉均为市售，粉碎备用。

中草药组方：王不留行、益母草、甘草按4∶3∶3混合，以上中草药均购自亳州药材市场，为饲料级，按上述配方比例混合，粉碎过40目筛，备用。

1.1.4 培养基。

乳酸菌培养基：MRS液体培养基;芽孢杆菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基;酵母菌培养基：马铃薯葡萄糖培养基。

固态发酵培养基：按“1.1.3”所述中药组方配制中药，将中药和玉米粉按8∶2混合均匀，作为固态发酵培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌筛选。

将7株酵母菌甘油管接种于马铃薯葡萄糖平板上，28 ℃静置培养2 d，挑较大菌落转接于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在温度30 ℃、转速100 r/min的恒温摇床上振荡培养24 h，得培养液，检测活菌数。将培养液在8 000 r/min下离心30 min，弃除沉淀，保留上清液，以产气荚膜梭菌ATCC13142作为指示菌，采用打孔法进行抑菌试验，测量抑菌圈直径。每个菌株进行3个重复，以活菌数和抑菌圈直径为标准筛选出发酵效果较好的酵母菌。

1.2.2 发酵种子液制备。

将“1.2.1”中筛选出的酵母菌接种至马铃薯葡萄糖液体培养基，枯草芽孢杆菌接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，在温度30 ℃、转速100 r/min的恒温摇床上振荡培养24 h，作为酵母菌和枯草芽孢杆菌种子液。植物乳杆菌接种至MRS液体培养基中，37 ℃静置培养12 h，备用。

1.2.3 非淀粉多糖酶使用。

将酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的种子液、木聚糖酶和纤维素酶M1、M2、M3、M4在水中充分溶解，作为发酵菌液与固态发酵培养基混合，物料发酵初水分约为40%，酵母菌、植物乳杆菌和木聚糖酶在物料中的接种浓度分别为1.0×105 CFU/g、1.0×106 CFU/g和3 000 U/kg，纤维素酶M1、M2、M3和M4在物料中的接种浓度均为2 000 U/kg。分装至带呼吸阀的发酵袋密封，37 ℃静置发酵5 d，测定发酵后物料中水分、总酸和中性洗涤纤维（NDF）含量，以发酵前样品为空白对照组，计算NDF降解率，每个处理进行3个重复，筛选出效果较好的纤维素酶。

1.2.4 体外消化处理。

参考廖睿等[12]和Regmi等[13]方法，略有改动，具体如下：

（1）胃缓冲液。

称取2.59 g氯化钠和0.25 g氯化钾，加350 mL去离子水溶解，用2 mol/L的盐酸在39 ℃下调节pH至2.0，冷却后将上述溶液转入500 mL容量瓶中定容。