湖光岩风景区耐高温微生物多样性分析及产酶特性研究

摘要 [目的]筛选湖光岩风景区耐高温菌株并且对其进行多样性分析以及产酶特性的研究。[方法]通过50 ℃高温分离与筛选，分离出耐高温微生物菌株，对分离得到的菌株划线纯化，并且进行16S rRNA鉴定，通过水解圈法进一步探究它们表现出来的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶的产酶能力。[结果]分离得到10株菌株，经过16S rRNA分析发现，有7株菌株属于芽孢杆菌（Bacillus），占耐高温菌株的70%，属于优势菌株，2株菌株属于短芽孢杆菌（Brevibacillus），1株菌株属于解脲芽孢杆菌（Ureibacillus）。对筛选出的耐高温菌株进行产蛋白酶、产纤维素酶及产淀粉酶的产酶能力研究，发现共5株表现出有产蛋白酶能力，有4株表现出有产淀粉酶能力，有4株表现出有产纤维素酶能力。[结论]湖光岩风景区耐高温菌株为芽孢杆菌，并且部分菌株具有产多种酶的能力。

关键词 耐高温;产酶特性;16S rRNA;生物多样性;湖光岩风景区

中图分类号 X172  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）18-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.18.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Diversity Analysis and Enzyme Production Characteristics of High-temperature Resistant Microorganisms in Huguangyan Scenic Area

LAI Chong-xi，LIU Huan-ming，TANG Jin-yan

（School of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Modern Agricultural Science and Technology Innovation Center，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective]The high temperature resistant strains of Huguangyan scenic area were screened and their diversity and enzyme production characteristics were studied.[Method]The high-temperature resistant microbial strains were isolated and screened at 50 ℃.The isolated strains were streaking purified and identified by 16S rRNA.The enzyme-producing capacities of protease，amylase and cellulase expressed by them were further explored by hydrolytic circle method.[Result]10 strains were isolated，according to 16S rRNA analysis，there were 7 strains belonging to Bacillus，accounting for 70% of the high-temperature resistant strains，belonging to the dominant strain，2 strains belonging to Brevibacillus and 1 strain belonging to Ureibacillus.The ability of protease production，cellulase production and amylase production of the selected high-temperature resistant strains was studied，and it was found that 5 strains showed protease production ability，4 strains showed amylase production ability，and 4 strains showed cellulase production ability.[Conclusion]The high temperature resistant strain in Huguangyan scenic area is Bacillus，and some strains have the ability to produce a variety of enzymes.

Key words High temperature resistance;Enzyme production characteristics;16S rRNA;Biodiversity;Huguangyan Scenic Area

耐高温微生物是一类最适生长温度大于50 ℃微生物的总称[1]，其通常分布在地质结构活跃的酸性硫磺区、淡水温泉和间歇喷泉深海火山口等[2]。虽然目前耐高温菌株的探究并不多，但是在实际的工业生产中已经有各种各样的研究应用，例如詹亚斌等[3]运用耐高温油脂降解菌株降解厨余垃圾，加快堆肥腐熟的过程;刘辉等[4]用耐高温的酿酒酵母进行酿酒，提高乙醇的生产效率，降低成本，提高乙醇的稳定性;侯世杰[5]利用耐高温复合菌剂对有机废弃物进行堆肥处理，实现废弃物的资源化回收;温俊丽[6]研究发现新的高温产电厚壁菌门细菌为高温燃料电池的研发提供了新的思路;Seesatat等[7]用嗜热木质纤维素分解菌对稻秆进行发酵并且在15 d达到了产甲烷和沼气的最大值;Liu等[8]研究发现嗜热细菌+ 0.2 g/g VSS烷基聚葡萄糖可以有效降解海洋养殖中产生的废弃物等。耐高温微生物与常规的微生物相比存在极大的优势，耐高温的特性使其在发酵工业、废水处理、工业生产等方面都有广泛的应用前景[9]。耐高温微生物产生的酶系具有催化效率高、对反应冷却系统要求低、热稳定性强、节约能源、专一性强等特点[10]，这些优点使得耐高温酶系一度成为人们的研究热点，其中以蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶尤为突出。Darwesh等[11]使用G550菌株产生的耐高温碱性蛋白酶作为生物防治剂抑制线虫的繁殖;Liu等[12]使用耐高温的纤维素酶发酵生产生物乙醇并且生产率达0.112 g/g干物底;Vaikundamoorthy等[13]研究表明海洋细菌蜡样芽孢杆菌产生的耐高温淀粉酶对海洋生物膜形成的细菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌表现出良好的抗生物膜活性，具有成为良好抗菌剂的潜力。这些都表明耐高温的微生物及其酶系已经成为人们的研究热点，但是目前所发现的耐高温的微生物及其酶系并不多，需要人们不断地探索，才能满足人们的生产以及科研的要求。

湖光岩坐落于我国大陆南端，具有特殊的玛珥火山地貌，是世界两大玛珥湖之一[14]。玛珥湖是由于火山爆发导致底层塌陷形成盆地，而火山的喷发物在附近形成“围墙”将其与周围环境分隔开，盆地形成积水最后变成湖[15]。也正是如此使得湖光岩玛珥湖可以记录下其气候的变化、季风的演变，而其土壤和湖水中很好地保存了各种各样的古细菌、耐高温菌、甲烷微菌、藻类、浮游植物等[16-18]。湖光岩的特殊地貌使得在这里生长的微生物与其他地区的微生物存在一定程度上的差别，有的学者也进行了关于湖光岩的微生物的多样性研究[19-21]，但是目前鲜见湖光岩耐高温微生物相关方面的研究。因此该研究通过对湖光岩耐高温微生物的多样性分析以及产酶特性的研究，为湖光岩的菌株开发利用提供参考，为耐高温微生物以及耐高温酶的丰富发展提供助力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。土壤样品，取自湛江市湖光岩风景区10 cm以下;革兰氏染色液试剂盒，北京陆桥技术股份有限公司;2×MightyAmp Buffer Ver.2、MightyAmp DNA 聚合酶，宝生物工程（大连）有限公司;16S rRNA 细菌通用引物1492R、16S rRNA 细菌通用引物27F、DL 2000 DNA Marker、ddH2O， 生工生物工程（上海）股份有限公司;核酸染色液，北京索莱宝科技有限公司;6×loading buffer、琼脂糖，广州艾基生物技术有限公司。

1.1.2 培养基。羟甲基纤维素纳培养基，参考张进良[22]的方法，即NaCl 6 g、CaCl2 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 2 g、（NH4）2SO4 2 g、CMC-Na（羧甲基纤维素钠）10 g、琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。脱脂牛奶培养基[23]：脱脂奶粉100 g、琼脂20 g、水1 000 mL，将配好的琼脂和奶粉进行分开灭菌，防止奶粉发生变性，琼脂121 ℃灭菌20 min，脱脂奶粉100 ℃，5 min。可溶性淀粉培养基：可溶性淀粉20 g、KNO3 1 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.5 g、FeSO4 10 mg、琼脂20 g，水1 000 mL。营养琼脂：琼脂20.0 g、牛肉膏 3.0 g、氯化钠 5.0 g、蛋白胨10.0 g。

1.1.3 仪器。AUY220 电子天平，日本岛津企业管理（中国）有限公司;SW-CI-2F 洁净工作台、BXP-280S 微生物培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;A300 梯度PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司;LS-B50L 立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司;H6-1 微型电泳槽，上海精益电器厂有限公司;DYY-8C 电泳仪，北京六一生物科技有限公司;JY3002 精密电子天平，上海精密科学仪器有限公司;L1100A 生物显微镜，广州粤显光学仪器有限公司;ZF-20D 暗箱式紫外分析仪，孔义市子华仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 湖光岩风景区耐高温微生物的分离纯化。称取10 g的土壤样品加至90 mL的无菌水中，振荡20 min使样品与无菌水充分混匀，配制成10-1的稀释液。取1 mL的稀释液加至9 mL的无菌水中依次配制成10-2、10-3稀释度的稀释液。取分别100 μL的10-2、10-3稀释菌液在营养平板上进行涂布分离，将涂布完成的平板在培养箱中正面放置10 min，待菌悬液吸收完全后再倒置进行50 ℃培养24 h，通过此法分离出的菌株为耐高温微生物。挑取涂布平板内菌落特征不一样的菌落用四分法划线于营养琼脂平板内，对菌株进行多次纯化直到分出单个菌落为止，并且制作成斜面进行菌种保藏。

1.2.2 耐高温菌株的鉴定。

1.2.2.1 形态学鉴定。从分离出的耐高温微生物菌种斜面上取一环菌株在营养琼脂上进行划线，在50 ℃恒温培养箱培养48 h，观察并且记录菌株的菌落形态，通过革兰氏染色进行制片，然后用显微镜进行观察，记录染色结果。

1.2.2.2 分子生物学鉴定。采用16S rRNA进行鉴定，对分离出的菌株进行划线，得到单菌落，采用细菌的DNA作为模板，用通用引物27F（- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -）和1492R（- GGTTACCTTGTTACGACTT -）进行PCR扩增。PCR反应体系30 μL：2×MightyAmp buffer 15.00 μL，MightyAmp DNA聚合酶0.75 μL，引物27F（10 μmol/μL） 0.75 μL，引物1492R（10 μmol/μL） 0.75 μL，ddH2O 12.75 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸90 s，进行40个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应保存。取4 μL的PCR扩增产物与1 μL的6×loading buffer混合在1%的凝胶中电泳，将PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列检测。将检测结果与EzBioCloud和NCBI中的碱基序列数据进行Blast对比，搜索出同源相关性最高的标准参考序列，对其构建系统发育树并且进行多样性分析。

1.2.3 产酶能力测定。

1.2.3.1 产蛋白酶能力。将筛选出的菌株挑取单菌落于脱脂奶粉平板上，50 ℃培养24 h，水解圈越大，产酶能力越强。

1.2.3.2 产淀粉酶能力。将筛选出的菌株挑取单菌落于可溶性淀粉平板上，50 ℃培养24 h，滴加卢戈氏碘液观察水解圈大小，水解圈越大，产酶能力越强。

1.2.3.3 产纤维素酶能力。将筛选出的菌株挑取单菌落于羧甲基纤维素钠平板上，50 ℃培养5 d，加入1%刚果红溶液，使刚果红溶液覆盖整个平板等待15 min左右，用1 mol/L氯化钠溶液洗去刚果红溶液，观察水解圈大小，水解圈越大，产酶能力越强。