微生物菌剂对栽培基质微生物群落的影响

摘要 [目的]了解微生物菌剂对栽培基质微生物群落的影响。[方法]以无土栽培基质、温室大棚栽培土壤为材料，采用高通量测序技术分析不同栽培土壤与栽培基质微生物群落结构差异，研究施用微生物菌剂哈茨木霉处理对辣椒栽培基质根际土壤微生物多样性的影响。[结果]辣椒根际土壤（T2）细菌的Chao1指数、Shannon指数均为最高，表明在不同栽培介质中，土壤栽培的根际土壤细菌群落丰富度和多样性均大于栽培基质。施用哈茨木霉后，栽培基质（T1）细菌类群高于对照（CK），分别增加了1门、4纲、9目、18科、40属，主要优势菌群变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度分别增加了3.73%、86.50%。真菌类群中主要优势菌群为子囊菌门（Ascomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、担子菌门（Basidiomycota），施用哈茨木霉后，真菌类群在属和种的水平上基本没有变化。哈茨木霉可以显著提高栽培基质细菌群落的多样性，而对真菌群落的多样性影响不明显。

关键词 微生物菌剂;栽培基质;辣椒;微生物群落;高通量测序

中图分类号 S 182  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）18-0060-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.18.015

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Microbial Agents on Microbial Community in Cultivation Matrix

CHEN Zhen1， ZENG Cui-yun2，3，ZHANG Yong-he1 et al

（1.School of Environment and Chemical Engineering，Lanzhou Resources and Environment Voc-Tech University，Lanzhou，Gansu 730021;2.College of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou，Gansu 730000;3.Northwest Collaborative Innovation Center for Traditional Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000）

Abstract [Objective]The aim was to understand the effect of microbial agents on microbial community in cultivation substrate.[Method]The high-throughput sequencing technology was used to analyze the differences in microbial community structure between different cultivation soils and cultivation substrates with soilless cultivation substrate and greenhouse cultivation soil as materials， and the effect of Trichoderma harzianum treatment on microbial diversity in rhizosphere soil of pepper cultivation substrate was studied.[Result]The Chao1 index and Shannon index of bacteria in rhizosphere soil of pepper （T2） were the highest， indicating that the richness and diversity of bacteria communities in rhizosphere soil cultivated in different cultivation media were greater than those in cultivation substrate.After the application of Trichoderma harzianum， the bacterial group in the cultivation substrate （T1 ） was higher than that in the control （CK）， which increased by 1 phyla， 4 classes， 9 orders， 18 families and 40 genera， respectively.The relative abundances of Proteobacteria and Firmicutes， the dominant bacterial groups， increased by 3.73% and 86.50%，respectively.The dominant fungal groups were Ascomycota， Mucoromycota， Chytridiomycota and Basidiomycota.After the application of Trichoderma harzianum， the fungal groups were basically unchanged at the genus and species levels.Trichoderma harzianum could significantly improve the diversity of bacterial communities in cultivated substrates， but had no significant effect on the diversity of fungal communities.

Key words Microbial agents;Cultivation substrate;Pepper;Microbial communities;High-throughput sequencing

无土基质栽培有效地解决了以往设施农业与露地农业生产争地的矛盾，实现了蔬菜对水分、肥料的高吸收[1]。甘肃现代丝路寒旱农业区通过循环利用玉米秸秆等农业废弃物，以及椰糠、草炭、牛粪等制作无土栽培基质，不仅解决了农业面源污染难题，而且实现了农果蔬结合、农牧互补和资源再利用的绿色循环发展[2]。无土基质栽培已成为现代丝路寒旱农业生产的重要环节，现已在我国西北地区大面积推广应用。由于基质是作物赖以生存的基础，戈壁农业中作物生长发育所需要的养分、水分和土壤微生物都需从基质中获得，尤其是土壤微生物与植物的生长和健康密切相关，是土壤肥力的重要组成部分和重要保障[3]。

微生物菌剂是从土壤或植物体内经筛选、分离后得到的一类菌群，再经过发酵等一系列工业化处理将这些微生物扩增培养后加工成一种液态或固态的活菌制剂，将其应用到农作物上，能够实现绿色无污染的现代化农业生产模式[4-5]。木霉菌（Trichodema spp.） 是自然界广泛分布的生防真菌，其中的绿色木霉（Trichoderma aviride） 和哈茨木霉（T.harzianum） 是常用的微生物菌剂[6-7]。近年来研究发现，哈茨木霉协同秸秆处理对马铃薯土壤微生物群落有一定影响，尤其对真菌群落多样性、群落结构组成影响较大[8]。施用微生物菌剂有利于改善土壤的微生物结构，增加土壤细菌、放线菌的数量[9]。

目前，关于河西走廊戈壁农业区无土栽培基质根际微生物现状以及微生物菌剂施用后对基质的根部微生物群落等影响报道较少。为此，该研究以温室大棚栽培土壤作为对照，对比其与栽培基质本身的微生物群落结构状况;并通过在基质上施用哈茨木霉，探讨微生物菌剂对基质微生物群落多样性的影响，以期为戈壁生态农业无土栽培基质中微生物菌剂的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物。供试辣椒（Capsicum annuum L.）品种为螺丝椒，市场购买，生产厂家为河北茂华种业有限公司。

1.1.2 供试微生物菌剂。哈茨木霉，主要菌种为哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum），有效活孢数≥10亿/g，市场购买，生产厂家为北海亦强生物科技有限公司。

1.1.3 供试基质。基质购自酒泉康多生态农业科技发展有限公司，以有机质为主要原料，通过高温发酵腐熟后，复配生物菌剂、草炭、珍珠岩，经自动化程序加工而成。其中有机质35%～45%，pH中性，腐殖酸15%～25%。

1.1.4 供试土壤。采自白银区水川镇桦皮川村农业示范园温室大棚。

1.2 试验设计

试验于2021年3—6月在白银市白银区水川镇桦皮川村农业示范园温室大棚内进行，以基质栽培为处理1（T1），以土壤栽培为处理2（T2），定植时将哈茨木霉菌对水稀释2 000倍后灌根，每株浇灌200 mL。设1个对照（CK），对照用清水喷施，其他栽培方式、条件相同。

取样：在定植移栽后60 d，按五点取样法采集0～20 cm土层基质（土壤）得到混合土样。迅速将土样保存于带有冰袋的保温箱中，带回实验室，于-20 ℃冰箱保存，备用。

1.3 土壤微生物群落测序

采用 Power Soil DNA Isolation kit 提取试剂盒（MOBIO），称取 0.5 g土样，按试剂盒说明书分别提取供试土壤（T2）、喷施哈茨木霉的栽培基质（T1）和对照（CK）的 DNA。用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳对 DNA的质量进行检测，测定DNA的纯度和浓度。样品总 DNA 提取后，对细菌16S rRNA V3-V4区和真菌18S rRNA V4区进行 PCR 扩增：细菌引物序列为341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）;真菌引物序列为V4F（5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′）和V4R（5′-ACGGTATCTRATCRTCTTCG-3′）。PCR 反应成分：Phusion DNA 聚合酶预混液 12.5 μL，上下引物各 2.5 μL，DNA 50 ng，补无菌水至 25 μL。PCR 扩增反应条件：98 ℃预变性 2 min;98 ℃变性 15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环;72 ℃ 延伸5 min。用 2% 的琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测，PCR 产物的回收采用 AXYGEN 公司的凝胶回收试剂盒，待测定后产物的浓度和特异性合格后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 数据统计与分析

利用 Uparse 软件对所有有效序列按 97%相似度进行分类操作单元（operational taxonomic units，OTUs）划分;然后选取每个 OTUs 中频数最高的代表性序列，进行物种注释，用 Mothur 方法将 OTUs 的代表序列与 SSUrRNA 数据库进行物种注释，最终获得分类学信息。统计各个样本的物种在门、纲、目、科、属和种分类水平上的分类单元数量。运用QIIME2软件计算各样本微生物群落的α多样性指数，以表征物种的丰富度、多样性及均匀度。采用语言的Venn Diagram包绘制各分类学水平上的细菌和真菌基因序列的Venn图。

2 结果与分析

2.1 哈茨木霉对辣椒根际土壤细菌和真菌组成及丰度的影响

从稀释曲线（图1）可以看出，从样本中随机抽取一定数量的序列，随着抽取的测序数据量的增加，细菌和真菌稀释曲线均基本趋于平缓，所有个体的深度测序指数（Coverage指数）在 0.996 9～0.999 7（表1），说明该研究的测序结果有足够的测序数据量，能反映当前样本所包含的多样性。