一个新合成化合物对烟草诱抗烟草花叶病毒的影响

摘要 ［目的］ 探究新合成化合物——茉莉酸甲酯（MeJA）类似物B2对烟草花叶病毒侵染（TMV）烟草的抑制效果及机理。［方法］ B2处理烟草叶片后，接种烟草花叶病毒，并测定了TMV在烟草叶片中的含量，超氧化物歧化酶（SOD）活性和脂氧酶（LOX）活性，调控茉莉酸信号途径的NtRab11基因、茉莉酸信号通路中的关键基因COI1、植物抗病基因介导的系统抗性中的标志基因PR-1a和PR-1b的相对表达量。［结果］ B2处理后，与对照相比，烟草叶片中的TMV含量有所下降，SOD和LOX活性提高，tRab11、COI1、PR-1a和PR-1b的相对表达量都有提高。［结论］ 新合成化合物B2对TMV侵染烟草有一定的抑制效果。

关键词 烟草花叶病毒；茉莉酸甲酯；诱抗

中图分类号 S 435.72  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）20-0130-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.20.033

Effect of a Newly Synthesized Compound on Tobacco Induced Resistance to Tobacco Mosaic Virus

CUI Shun-yan，WANG Yue，XIN Xue-cheng et al

（Shenyang Research Institute of Chemical Industry Co.，Ltd.，Shenyang，Liaoning 110021）

Abstract ［Objective］To explore inhibitory effect and mechanism of a newly synthesized compound methyl jasmonate analogue B2 on tobacco infected by tobacco mosaic virus （TMV）.［Method］ After treated with B2，tobacco leaves were inoculated by TMV，then TMV content in tobacco，SOD and LOX activity，and the relative expression levels of NtRab11，COI1，PR-1a and PR-1b were measured.［Result］Compared to controls，TMV content in tobacco leaves was decreased，SOD and LOX activity were increased，and relative expression levels of NtRab11，COI1，PR-1a and PR-1b were increased after treated with B2.［Conclusion］A newly synthesized compound B2 has certain inhibitory effect on TMV infection of tobacco.

Key words Tobacco mosaic virus；Methyl jasmonate；Resistance

植物体内的免疫机制，如同人类注射疫苗，经诱导因子处理后，植物体内的免疫体系被快速激活来防御外源病原体的侵染。烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是一种RNA病毒，在烟草生长过程中，一类最为普遍发生的病害，对烟草质量造成严重影响。近年来，各国学者对TMV的防治进行了大量研究，与化学药剂防治措施相比，作物免疫调控抗病有诸多优点，引起各界的广泛重视。茉莉酸甲酯是一种植物生长调节剂，对植物的生长发育极为重要，涉及多种生理过程，如生长、发育、代谢等，且是植物抗病信号的传递体之一［1 - 2］。禹艳红等［3］研究表明用茉莉酸甲酯处理，能提高抵抗黄瓜花叶病毒的侵染，还指出烟草对黄瓜花叶病毒的抗性与SOD活性有较强的相关性。宾金华等［4］指出茉莉酸甲酯的施用能明显提高烟草的LOX活性、病源相关蛋白含量等，这些指标的变化与提高抗性密切相关。

笔者研究了新合成的化合物——茉莉酸甲酯类似物B2对TMV侵染烟草的抑制效果，通过测定调控茉莉酸信号途径的NtRab11基因、茉莉酸信号通路中的关键基因COI1、植物抗病基因PR-1a和PR-1b的相对表达量探讨了新合成化合物B2的诱导抗病机制。

1 材料与方法

1.1 材料 供试品种为普通烟NC89; 烟草花叶病毒（TMV）由沈阳中化农药化工研发有限公司生测研发部提供。

试验药剂为新合成的化合物，为N-（4-甲基苯基）-2-（3-氧代-2-戊基环戊基）乙酰胺。该化合物为茉莉酸甲酯类似物，因此该研究选取茉莉酸甲酯作为阳性对照药剂，其结构式见图1。

1.2 方法

1.2.1 试验前处理。将新化合物B2和阳性对照药剂——茉莉酸甲酯先用二甲基亚砜溶解，然后配制成500 mg/L的溶液，选取长势一致的5 ～ 6片叶龄的烟草植株上施药，对照喷洒清水。

于药剂处理3 d后接种烟草花叶病毒，每株接种施药叶片以上的第一片叶片。接种方法为摩擦接种，制备接种毒液：称取1 g新鲜带病毒叶片，以100 mL （pH 7.0） 的磷酸缓冲液进行研磨，然后过4层纱布即得滤液，接种时加入少量60目的石英砂，用手指蘸取少量接种液，在烟草叶片正面轻轻摩擦，力度掌握在刚刚能在叶面造成微伤口即可，每个处理8个平行样，2次重复，将接种后的植株放置在日光温室中培养。分别于接种病毒7、10和13 d后按照烟草病害分级及调查方法（YC/T 39—1996）进行调查，计算病情指数。

病情指数计算公式：

X=（Ni×i）N×9×100

式中，X为病情指数，Ni为各级病叶数，i为相对级数，N为调查总叶数。

1.2.2 烟草花叶病毒含量测定。TMV接种后，分别于5、6、7、8、9 d取不同处理的烟草叶片，用液氮进行研磨匀质后，称取0.2 g，利用ELISA试剂盒（上海酶联生物）测定TMV含量。

1.2.3 酶活性测定。TMV接种后，分别于0、2、4、6、8、10 d取不同处理的烟草叶片，用液氮研磨成粉末状态，称取1 g，加入各自待测酶的缓冲液研磨匀质后，离心（12 000 r/min，20 min，4 ℃），上清液测定酶活性。按照宋凤鸣等［5］的方法测定超氧化物岐化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性，参照Koch等［6］方法测定脂氧酶（Lipoxygenase，LOX）活性。

1.2.4 RNA 提取和qRT-PCR测定相关基因的表达。

B2处理后，在24、48、72 h 取不同处理的烟草叶片，用液氮处理后，保存在-80 ℃冰箱中，以备检测相关基因的表达。

总RNA按照 TRIzol试剂盒（Invitrogen，San Diego，CA）的用户手册提取，并根据Super Smart cDNA Synthesis Kit （TaKaRa，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser） 的说明反转录cDNA。qRT-PCR在CFX Connect1M Real-Time System （Bio-Rad，USA） 根据 SYBR Green I Master mix kit （Takara）的说明进行。以 β-actin为内参， 采用2-△△CT 法计算相对表达水平。使用的基因特异性引物：对于NtCOI1，5′-TGCTTGACCGAGAGGAGAGA-3′ 和5′-CGCCCGACATAACTGAGACC-3′; 对于acidic PR-1，5′-GTCCATACTAATTGAAACGACCTAC-3′和 5′-CCACTTCAGAGGATTACATATATAGTAC-3′; 对于basic PR-1，5′-TTTTGGTGGTATTATGGAGGTGTG-3′和 5′-ACAATTAACTGCCGTTGACTCATC-3′; 对于NtRab11，5′-GACATCAACGGAAAGGAGGTTA-3′ 和 5′-GCTCCAACTGCACTCCTATAAT-3′；以 β-actin （5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′ 和 5′-GGTGCAACGACCTTAATCTTCAT-3′） 用作内部对照。

1.3 数据分析 采用Microsoft Excel 2010进行数据分析，结果用平均值±标准偏差来表示。

2 结果与分析

2.1 新合成化合物B2抑制感染烟草花叶病毒的效果

从接种病毒后7、10和13 d的调查结果看出，用新合成化合物B2处理后的烟草，与清水（空白对照）相比，病情指数明显降低。由表1可知，以接种病毒后10 d调查结果为例，B2和茉莉酸甲酯处理后，病情指数明显小于清水处理，清水处理后的病情指数为 47.22；新合成化合物B2处理后，病情指数为20.39，茉莉酸甲酯处理后，病情指数为24.31，表明茉莉酸甲酯和B2可显著抑制烟草植株感染TMV。茉莉酸甲酯与B2处理后的病情指数无明显区别，但B2处理后抑制TMV感染效果略优于茉莉酸甲酯的处理效果。

2.2 B2对TMV的抑制效果

通过采用间接ELISA法测定TMV的结果显示（图2），用B2处理的烟草在接种TMV病毒5 d后，处理组的OD492为2.84，而对照组的OD492为9.76，之后对照组的OD492迅速上升，9 d后对照组的OD492达到处理组的2.8倍，5 ～ 9 d的检测结果显示，对照组与B2处理组均达显著差异。ELISA法的测定结果证明了新合成化合物B2对TMV侵染烟草的抑制效果。

2.3 B2处理后接种叶片中SOD和LOX活性变化 由图3可知，B2处理后，烟草叶片中SOD活性迅速增加，且显著高于对照组。处理组和对照组中SOD活性的峰值均出现在B2处理2 d后，之后缓慢降低。

由图4可知，对照组的脂氧酶活性在接种TMV后无明显变化，而B2处理组的脂氧酶活性在接种TMV后迅速升高，在接种病毒第2天时达到峰值，其活性为4.3 μg/（mg·h），是对照组的4.8倍。之后，第4天开始处理组的脂氧酶活性有所降低，但均高于对照组。

2.4 B2处理对NtRab11基因表达量的影响

研究发现，作为水稻中茉莉酸介导的关键基因， OsRab11和茉莉酸信号途径中的OsOPR8基因有互作效应，水稻中的OsRab11基因可通过调节茉莉酸生物合成作用于茉莉酸信号通道［7］。由图5可知，B2处理2 h后，NtRab11基因的表达量有明显的上调趋势，在6 h时，NtRab11基因的相对表达量为空白对照的6.2倍，之后，NtRab11的相对表达量缓慢降低，在12 h时，相对表达量为空白对照的4.0倍。

2.5 B2处理后COI1、PR-1a和PR-1b 的相对表达量的变化 由图6可知，经B2处理后，随着诱抗时间的增加，茉莉酸信号通路中的关键基因COI1、植物抗病基因介导的系统抗性中的标志基因PR-1a和PR-1b的表达量均表现出增加趋势。COI1相对表达量稳步提高，在72 h时达到4.8倍。PR-1a和PR-1b基因的表达量与对照相比均有提高，且随着诱抗时间的增加而提高，在72 h时PR-1a和PR-1b基因的相对表达量为空白对照的5.2和3.1倍。

3 结论与讨论