9株野生根瘤菌的分离鉴定及60Co耐受•吸附性研究

摘要 从野生豆科植物根瘤中分离、纯化、筛选出生物活性好的根瘤菌进行种属鉴定，模拟检测其对60Co的耐受性和吸附能力，为放射性钴污染水体、土壤生物修复提供目标菌株。用平板培养法从不同植物根瘤中分离到根瘤菌株9株，使用多位点序列（16S-IGS、nifH、recA）分析方法对获得的根瘤菌进行分子鉴定，并检测理化性质，在不同浓度59Co培养基中培养根瘤菌菌株，检测其对59Co的耐受性和吸附能力，并使用60Co辐射源装置对根瘤菌株进行照射处理，检测其对放射性的耐受能力。结果表明，9株菌株均为革兰氏阴性菌，其中1#、2#、6#、7#菌株为共生固氮菌、慢生菌，3#、4#、5#、8#、9#为联合固氮菌、快生菌；4#、5#、7#、8#、9#菌株具有氨苄抗性。经分子鉴定，1#、2#、6#为Bradyrhizobium japonicum，3#、8#为Sinorhizobium meliloti，4#、5#为Rhizobium sp.，7#为Bradyrhizobium yuanmingense，9#为Rhizobium huautlense；5#菌株对59Co的耐受能力最好，7#最差。初始59Co浓度为1 g/L和吸附时间1.5 h条件下，9#菌株对培养基中59Co的残余量最低，说明该菌株的清除能力最强，达到15%。60Co辐射源装置对9个根瘤菌株进行照射处理，所有菌株均不能耐受1～10 kGy γ射线辐照剂量处理。从试验结果来看，5#菌株和9#菌株对59Co分别表现出较好的耐受性和吸附性，在修复低放射性60Co污染水体、土壤中具有一定的潜力。

关键词 60Co；根瘤菌；生物修复；分离鉴定；耐受性；吸附性

中图分类号 X591  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）21-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.21.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Isolation and Identification of 9 Wild Rhizobium Strains and 60Co Tolerance and Adsorption

FU Yi， LIU Mian-xue， WANG Yan et al

（Sichuan Institute of Atomic Energy， Sichuan Province Key Laboratory of Irradiation Preservation，Chengdu，Sichuan 610101）

Abstract Rhizobia with good biological activity were isolated， purified and identified from the root nodules of wild legumes， and their tolerance and adsorption capacity to 60Co were simulated to provide target strains for the bioremediation of water and soil polluted by radioactive cobalt. 9 Rhizobium strains were isolated from different plant root nodules by plate culture method. The Rhizobium strains were identified by multi site sequence （16S-IGS， nifH， recA） analysis， and their physical and chemical properties were detected. The tolerance and adsorption of the Rhizobium strains were detected in 59Co medium with different concentrations. The radioactivity tolerance of the Rhizobium strains were detected with 60Co radiation source device. The results showed 9 strains were Gram-negative bacteria， 1#， 2#， 6#， 7# strains were symbiotic nitrogen fixing bacteria， slow-growing bacteria， 3#， 4#， 5#， 8#， 9# strains were combined nitrogen fixing bacteria and fast-growing bacteria;4#， 5#， 7#， 8#， 9# strains had ampicillin resistance. Through molecular biology identification， 1#， 2#， 6# were Bradyrhizobium japonicum， 3#， 8# were Sinorhizobium meliloti， 4#， 5# were Rhizobium sp.， 7# was Bradyrhizobium yuanmingense and 9# was Rhizobium huautlense. 5# strain had the best tolerance to 59Co and 7# the worst.Under the condition that the initial 59Co concentration was 1 g/L and the adsorption time was 1.5 h， the 9# strain had the lowest residual amount of 59Co in the medium， indicating that the strain had the strongest scavenging ability， reaching 15%.9 strains were irradiated by 60Co radiation source device， and all strains were not survive by 1-10 kGy γ radiation dose treatment. The results indicated that the 5# strain and the 9# strain showed good tolerance and adsorption to 59Co， respectively， and had a certain potential in the restoration of low-radioactive 60Co polluted water and soil.

Key words 60Co;Rhizobium;Bioremediation;Isolation and identification;Tolerance;Adsorption

随着核工业的发展，核安全事故也严重威胁着人类的健康，2021年日本宣布向太平洋排放核废水更是对全人类的生命健康造成威胁［1］。核技术应用带来的核污染如控制不利，将长期威胁到人类的健康与安全。放射性核素60Co广泛应用于农业、工业、放射医疗等行业，也发生过一些核安全事故［2-3］，核电站泄露产生的放射性污染中也存在60Co［4］，造成放射性污染，如20世纪90年代，在山西省忻州由于转运废弃放射源时遗漏60Co废料而造成重大核污染事故，导致多人死亡，因此，针对60Co的放射性污染处理技术开发有着迫切的现实需求。

目前，用于核污染水体、土壤修复方法主要有物理法、化学法等［5-6］，然而这些技术需要复杂设备条件、巨额的花费。而生物修复技术具有效率高、安全性能好、费用低、易于管理与操作等优点，在修复核素污染水体、土壤中的作用越来越重要。国内外的研究表明利用微生物、植物吸附污染水体、土壤中的重金属、核素是一种有效且价廉的修复污染的方式［7］，加上利用生物技术对植物、微生物的目的性改造，使生物修复技术具有巨大的社会、经济价值［8］。

根瘤菌是生活在土壤中的革兰氏阴性杆状细菌，在合适的条件下，根瘤菌能侵染豆科植物，通过类菌体形式与豆科植物建立共生关系，使根的局部膨大形成根瘤，为植物提供氮源，同时植物供给根瘤菌以矿物养料和能源［9］。长期研究中发现根瘤菌的活动与钴（Co）存在紧密的联系，根瘤菌在其代谢活动中可合成钴胺素——一种含Co的维生素B类大分子物质；Co是根瘤菌与植物共生的必需元素，Dilworth等［10］报道缺Co导致根瘤短小，而恢复Co元素供应后，侧根上Co富集浓度增加。Riley等［11］报道在羽扇豆中由于土壤缺Co，造成根瘤菌浸染的种子成瘤率降为30%，未浸染种子的成瘤率降为13%。由于根瘤菌与Co元素的特殊关系，使利用根瘤菌修复Co污染水体、土壤具有易于回收的优势。目前，利用根瘤菌与植物共生修复铜［12-13］、镉［14-15］、多环芳烃［16］等污染土壤均有报道，但是用于放射性核素60Co的报道较少。

该研究分离纯化采自多个地区的野生植物根瘤菌，对其进行理化性质分析和分子鉴定，并对纯化菌株进行模拟60Co耐受及吸附能力研究，探讨根瘤菌用于放射性60Co污染水体、土壤修复的可能性。

1 材料与方法

1.1 菌株采集、分离与纯化

采摘自四川成都菜地、海南石碌铜矿区等地的大豆、紫花苜蓿、猪屎豆等植物根系（表1），按照高亚梅等［17］的方法分离纯化根瘤菌。

1.2 菌株形态特征观察

按照张俊杰等［18］的方法进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察菌体形态、大小；在YMA 平板上培养72 h观察菌落形态特征。

1.3 生理生化特征的测定

依据《伯杰细菌鉴定手册》［19］，用HB8540（青岛海博）无氮培养基测定根瘤菌固氮类型，用0.5%BTB YMA液体培养基测定根瘤菌产酸碱性。

1.4 分子鉴定

菌体培养和根瘤菌总DNA提取参考谷峻等［20］的方法进行。使用多位点序列分析方法对分离到的根瘤菌进行分子鉴定。设计检测引物位点为16S-IGS、nifH、recA，合成引物分别为16S-IGS（上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，下游引物5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）、nifH（上游引物5′- TAC GGN AAR GGS GGN ATC GGC AA -3′，下游引物5′- AGCATGTCYTCSAGYTCNTCCA -3′）、recA（上游引物5′- TTC GGC AAG GGM TCG RTS ATG -3′，下游引物5′- ACA TSA CRC CGA TCT TCA TGC -3′）。

PCR反应总体积为50 μL，其中包括TaKaRa EX Taq酶0.25 μL、10×PCR缓冲液5 μL、MgCl2 4 μL、引物各2 μL、模板DNA 2 μL。PCR 程序：

①16S-IGS，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 90 s，35个循环，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min；

②nifH，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min；

③recA，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min。

PCR产物由上海英骏生物技术有限公司进行测序，使用blastn在线搜索高度相似序列，使用Mega 5.0软件进行多序列比对，确定测试菌株的进化分类。

1.5 抗逆性试验

以YMA培养基为基本培养基。内源抗生素抗性试验设置Amp/Kan/Str的终浓度为5、25、50、100 μg/L；耐盐试验设NaCl终浓度为0、0.1%、0.5%、1.0%、5.0%、10.0%共6个梯度；酸碱试验设置pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0共11个梯度。分别接种后置于28 ℃恒温培养。接种后于第7天观察结果。以上试验均设空白对照，3次重复，无菌操作。

1.6 根瘤菌辐照耐受能力测定

YMA培养基中28 ℃摇菌48 h，6 000 r/min 5 min离心沉淀菌体，使用0.1 mol/L PBS缓冲液重悬细菌，重复3次后备用。使用60Co辐射源装置对根瘤菌株进行照射处理，辐照剂量为1、3、5、8、10 kGy；使用电子加速器对根瘤菌菌株进行照射处理，辐照剂量为50、100、150、200、250 Gy；使用平板稀释法计算致死率；以上试验均设无辐照空白对照，3次重复，无菌操作。