纤维素降解菌的筛选及对玉米秸秆降解的影响

摘要  ［目的］通过筛选纤维素降解能力强的微生物，探索纤维素降解菌应用农田生态系统加快秸秆降解还田应用前景。［方法］采用平板稀释法、液体培养基富集法、刚果红染色法、滤纸条崩析法从长期覆盖秸秆土壤中分离出10株菌株，并通过测定不同菌株纤维素酶的活性、不同菌株组合对玉米秸秆干物质降解的影响和不同菌株组合对玉米秸秆纤维素、半纤维素、总有机碳含量的影响，筛选出3株纤维素降解能力较强的单一菌株；利用16S rDNA基因序列的同源性对比结果，并将其作用于玉米秸秆进行堆肥观测其降解的效果。［结果］S10为栗褐链霉菌、S20为枯草芽孢杆菌、S30为栗褐链霉菌。S10S20S30混合三菌株组合降解玉米秸秆干物质能力与对照相比均有明显的提高，在第2天、第4天、第6天、第8天、第10天对玉米秸秆干物质降解分别提高了94.58%、75.50%、119.10%、123.44%、143.86%；混合菌株处理玉米秸秆的效果强于单菌株的，尤其是S10S20S30混合三菌株效果最好。［结论］混合菌株作用玉米秸秆的纤维素降解能力显著高于单菌株；其中混合菌株S10S20S30的降解纤维素能力最强，可作为高效纤维素降解菌加快秸秆还田，减少环境污染。

关键词  纤维素降解菌；筛选；玉米秸秆；降解

中图分类号  S 141.4文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2022）22-0052-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2022.22.014

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of Cellulose-degrading Bacteria and Their Effect on Corn Straw Degradation

ZHANG Peng-fei，MENG Hui-sheng，JING Guo-yan et al

（College of Resources and Environment，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801）

Abstract  ［Objective］To explore the application prospect of cellulose-degrading bacteria in farmland ecosystem to accelerate straw degradation and return by screening microorganisms with strong cellulose degradation ability.［Method］ Ten strains were isolated from straw mulched soil by plate dilution method，liquid medium enrichment method，Congo red staining method and filter paper fragmentation method.Three single strains with strong cellulose degradation ability were screened out by measuring the cellulase activity of different strains，the effects of different strains combination on dry matter degradation of corn straw and the effects of different strains combination on cellulose，hemicellulose and total organic carbon content of corn straw.The 16S rDNA gene sequence was used to contrast the results，and it was applied to compost of corn straw to observe its degradation effect.［Result］S10 was Streptomyces chinensis，S20 was Bacillus subtilis and S30 was Streptomyces chinensis.The dry matter degradation ability of S10S20S30 was significantly improved compared with the control，and the dry matter degradation ability of S10S20S30 was increased by 94.58%，75.50%，119.10%，123.44% and 143.86% on the 2nd，4th，6th，8th and 10th days，respectively.The effect of mixed strains on corn stalks was stronger than that of single strains，especially S10S20S30 mixed three strains had the best effect.［Conclusion］The cellulose degradation ability of mixed strain was significantly higher than that of single strain.Among them，the mixed strain S10S20S30 had the strongest ability to degrade cellulose，which could be used as an efficient cellulose degrading bacterium to accelerate straw returning to the field and reduce environmental pollution.

Key words  Cellulose-degrading bacteria;Screening;Corn straw;Degradation

我国秸秆资源种类丰富、分布广泛。据统计，我国每年可以产生10.4亿t的秸秆，占世界秸秆总产量的20%～30%［1］。目前我国处理秸秆多采用秸秆还田的方式。秸秆还田虽然能释放有机物质改善土壤结构［2］，但秸秆中有大量的纤维素、半纤维素等，在自然状态下降解比较长，在此期间有可能会影响种子的正常生长。如何合理利用秸秆，缓解农村能源物资缺乏严重的现象已经成为我国一个难题［3］。自2000年，我国就颁布了关于秸秆一系列如何利用和解决秸秆禁烧的政策［4］。但秸秆焚烧的现象还是随处可见，因此如何合理使用秸秆并且提高秸秆的利用率仍然是社会关注的焦点。

相比较使用化学方式处理秸秆的方法，低成本、无污染的微生物降解方法更具有研究价值。微生物降解法是快速降解纤维素的一种快速有效的方法，主要利用土壤中原有的微生物，增加微生物酶的活性对秸秆进行降解。研究表明，正确合理使用微生物降解菌剂可以降低水稻秸秆的强度，明显促进土壤中的养分、微生物多样性等，从而使作物在一定程度上增产增收［5］，对农业可持续发展具有重要作用。

在自然环境中，纤维素降解菌的种类丰富且数量庞大，主要包括纤维黏菌和纤维杆菌等细菌，纤维放线菌、诺卡氏菌属和霉菌属等放线菌，木霉属、曲霉属、青霉素等真菌［6］。生存环境也各式各样，如动物肠胃、土壤、森林等。研究表明，纤维素降解菌可增强土壤降解秸秆能力，对农业废弃物有重要的作用。如纤维素转化商用酶作用于玉米秸秆等不同种类的木质素原料［7］；从臧牛胃中分离出来2株纤维素降解菌作用于青贮饲料，结果发现纤维素菌落可改善饲料品质。虽然菌类资源丰富，但目前发现的可实际应用于农田并降解秸秆的较少。该研究主要是通过试验筛选与构建高效纤维素微生物菌群，加快玉米秸秆还田速度，对合理利用秸秆资源、减少环境污染具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集。土壤样品采自山西省晋中市太谷区山西农业大学资源环境学院试验田（含枯枝落叶、腐败秸秆、动物粪便等的土壤）。

1.1.2 培养基。菌株的筛选和分离采用羧甲基纤维素培养基和赫奇逊液体培养基［8］；保存菌株采用液体LB培养基［9］；初筛菌株纤维素能力采用滤纸条培养基［10］。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离、筛选。

称取采集的样品土10.00 g，并在无菌条件下放于装有90.00 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀并静置，稀释成10-5、10-62个浓度菌液。用移液枪取0.1 mL 10-5稀释液涂布于好氧性纤维素分解培养基平板上，同样的方法取10-6稀释液并涂布。每个稀释度涂布3个平板，30 ℃培养箱培养5 d左右。每个菌落挑选单个菌株置于好氧性纤维素分解培养基，每皿2个，然后1 mol/L刚果红染色15 min，然后用1 mol/L NaCl浸洗，在12、24、36 h测定每个菌落直径（d）和其产生水解圈直径（D），并计算水解圈直径（D）和菌落直径（d）的比值（D/d）。水解圈与菌落直径比值可以简单判断该菌株的纤维素降解能力。

1.2.2 菌株的鉴定。

对筛选出的菌株进行生理生化鉴定［11］，同时利用16S rDNA测得基因通用引物（S10：5′-AAGTCGAACGATGAACCA-3′、S20：5′-GCAGTCGAACGATGAAGC-3′、S30：5′-AAGTCGAACGATGAAGCC-3′）扩增菌株的16S rDNA基因片段。运用NCBI Blast分析工具对测序结果进行比对，从而鉴定菌株。

1.2.3 玉米秸秆降解试验。将粉末状500 g的玉米秸秆放在花盆里，置于30 ℃的环境中，试验设7个处理，分别为CK（不加菌剂，加等量清水）、S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S10S20S30，每盆加入10 mL菌剂，每隔2 d观察玉米秸秆干物质降解率，培养20 d后，测定总碳、纤维素、半纤维素含量。干物质降解率=（发酵前的干物质量-发酵后的干物质量）/发酵前干物质量×100%。

1.2.4 测定方法。

采用水解圈和菌落直径比值、滤纸条的降解效果2种方法进行初筛菌株。菌株纤维素酶、内切葡聚糖酶、滤纸酶（FPA）活力参照刘东阳等［12］的方法进行测定。

纤维素采用范氏法-重量法［13］进行测定；半纤维素采用2 mol/L盐酸水解法和DNS法相结合［14］进行测定；总有机碳采用TOC分析仪法［15］进行测定。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2019对原始数据进行整理，采用SAS对试验结果进行方差分析，并用 Duncan′s 新复极差法进行差异显著性检验（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的分离与筛选

纤维素降解菌分解纤维素能力以水解圈与菌落直径的比值来判定。从分离的10株菌株初步筛选3株纤维素降解能力较强的S10、S20、S30。由表1可知，S10、S20、S30这3个菌株水解圈与菌落直径的比值（D/d）随着时间的增加而增加。菌株S10和S20的水解圈和菌落直径的比值较大，培养36 h比值分别为6.12和6.0 而S30的比值为4.5 远远小于S10和S20。

2.2 不同菌株的滤纸降解效果与纤维素酶活性

以定性滤纸为底物初步研究纤维素降解菌的分解能力，结果如表2所示。纤维素分解菌S10菌株和S20菌株具有较强的滤纸分解性能，静置3 d后可以清晰地观察到滤纸有明显的降解，5 d 后培养基开始变黄，到第7天滤纸条明显开始崩解。S30菌株在第3天没有明显的变化，到第5天开始滤纸条降解，到第7天培养基才开始变黄。由此可见，S10、S20菌株纤维素降解能力强于S30菌株。