剑河白香猪IL-18基因克隆与序列分析

摘要  为测定剑河白香猪IL-18核苷酸序列结构，采集剑河白香猪脾脏，提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR 法扩增cDNA，将从凝胶中收集的DNA与PMD19-T Vector连接，转入E.coli DH5a感受态细胞，将感受态细胞在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，挑选单个白色菌落，用PCR法确认重组质粒中IL-18基因长度大小。结果表明：测得IL-18全基因长度为579 bp，编码192个氨基酸，与荣昌猪、内江猪、GenBank的序列AY262109、AY262109进行比较，核苷酸同源性分别是99.1%、99.5%、99.8%、99.8%，推导的氨基酸同源性分别是98.4%、99.5%、100%、100%。

关键词  剑河白香猪IL-18；基因克隆；序列分析

中图分类号  S 828文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2022）22-0082-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2022.22.020

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Cloning and Sequencing of IL-18 Gene in Jianhe Baixiang Pig

YANG Xian-fu，BAO Tao-tao，YUAN Xiao-juan et al

（Animal Disease Prevention and Control Center of Qiandongnan Prefecture， Qiandongnan， Guizhou 556000）

Abstract  In order to determine the structure of the IL-18 nucleotide sequence in Jianhe Baixiang pig.The spleen of Jianhe Baixiang pig was collected， the total RNA was extracted， reverse transcribed into cDNA， amplified cDNA by PCR method， the DNA that collected from the gel connected with PMD19-T Vector， and it was transfered into E.coli DH5a competent cells， the competent cells were cultured on L-agar plate medium that containing X-Gal， IPTG， and Amp， a single white colony was selected， and the length of the IL-18 gene in the recombinant plasmid was confirmed by PCR.The whole length of IL-18 gene was 579 bp，encoding 192 amino acids，compared with Rongchang pig，Neijiang pig，AY262109 of GenBank and AY262109 of GenBank sequence，the nucleotide homology is 99.1%，99.5%，99.8% and 99.8%，the deduced amino acid homology is 98.4%，99.5%，100% and 100%.

Key words  Jianhe Baixiang pig IL-18;Gene clone;Sequence analysis

白细胞介素18（IL-18），是动物体内一种重要的细胞免疫调节因子，1989年首次被描述［1］，1995年日本学者 Okamura等［2］从中毒性休克的鼠肝脏中分离并克隆出了该因子，1996年正式命名为白细胞介素18［3］，1999年Muneta等［4-5］从猪肺泡巨噬细胞中克隆到IL-18；IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节、抗超敏反应、抗自身免疫性糖尿病、抗类风湿性关节炎等方面有着积极的作用［6-7］。剑河白香猪产于贵州省剑河县的丛林山寨中，

是一种微型猪，生活条件带有野性的特殊猪种。当前国内外关于该猪种IL-18基因的研究鲜见报道。笔者通过引物设计、反转录、PCR、质粒载体构建技术克隆剑河白香猪的IL-18全基因，旨在为研究和开发猪IL-18免疫增强剂及有效控制猪病毒性传染病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品 采集剑河白香猪原种场的5周龄仔猪脾脏，取脾脏20 mg，剪碎，放入1.5 mL离心管中，加100  μL生理盐水，用组织匀浆机破碎，备用。

1.2 主要试剂 EastepP Super总 RNA提取试剂盒，购自上海普洛麦格生物产品有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DL 2000 DNA Mkaker、TaKaRa miniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、 miniBEST Plasmid purification Kit、E.coli DH5a、琼脂糖、L-琼脂培养基，购自宝生物工程（大连）有限公司；

X-gal溶液、IPTG溶液、氨苄青霉素溶液，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 引物 根据GenBank收录的猪IL-18基因序列（Y11132），采用oligo7引物设计软件，设计扩增剑河白香猪IL-18基因序列引物：正向引物（P 1），5′-ATGGCTGCTGAACCAGAAG-3′；反向引物（P 2），5′-CTAGTTCTTGTTTTGAACAGTGAACATTAT-3′。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 总RNA的提取

在处理好的样品中，每管加入500 μL RNA裂解液，颠倒离心管5次；然后加入500 μL稀释液，混匀，以12 000 r/min离心5  min；在上清液中加入400 μL无水乙醇，混匀；将混合液转移至离心柱（每管上清液分装2个离心柱），12 000 r/min离心1 min，弃滤液；加入DNA酶 Ⅰ 5 μL，孵育液孵育15 min；加入600 μL洗液，12 000 r/min离心45 s，弃滤液；再重复洗1次；将离心柱重新放置于收集管上，12 000 r/min 离心2 min；将离心柱置于洗脱管上，加入100 μL无核酸酶水，12 000 r/min离心1 min；收集的RNA保存于-70 ℃。

1.5 cDNA的合成 在微量反应管中配制下列反应混合液：Random 6mers 1.5 μL；dNTP Mixture 1.0 μL；模板RNA 6.0 μL；RNase Free dH 2O 1.5 μL；65 ℃保温5 min后，冰上迅速冷却。在上述微量反应管中再加入下列反转录反应液：5×PrimeScriptⅡ Buffer 4.0 μL；RNase Inhibitor 0.5 μL；PrimeScriptⅡ RTase 1.0 μL；RNase Free dH 2O 4.5 μL，缓慢摇匀。按照以下条件进行反转录：30 ℃  10 min，45 ℃  45 min，95 ℃  5 min，冰上冷却。

1.6 PCR扩增条件优化

PCR反应液的配制：PrimeSTAR Max Premix（2×） 25.0 μL；Primer1  1.2 μL；Primer2  1.2 μL；cDNA模板0.5 μL；灭菌蒸馏水 22.1 μL。PCR反应条件优化：裂解温度为98 ℃，裂解时间10 s，退火温度分别采用53、55、57、59 ℃，退火时间均为5 s，延伸温度均为72 ℃，延伸时间均为5 s。同时设阴性对照管，共35个循环。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察4个不同退火温度条件下cDNA扩增的效果。

1.7 从琼脂糖凝胶中回收DNA

把1%琼脂糖凝胶放在切胶仪上，切除含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用吸湿纸吸干凝胶表面的液体；按照TaKaRa miniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0提供的操作方法提取DNA，于-20 ℃保存DNA。

1.8 剑河白香猪

IL-18基因质粒构建在微量反应管中配置下列溶液：pMD19-T Vector 1 μL，Insert DNA 0.15 pmol，灭菌水3 μL，加入5 μL Solution Ⅰ，16 ℃反应30 min。将上述10 μL溶液加入至100 μL DH5a感受态细胞中，放置冰中30 min；42 ℃加热45 s后，再在放置冰中1 min；加入890 μL SOC培养基，37 ℃振荡培养60 min；在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上，形成单菌落。

1.9 重组质粒DNA提取

从L-琼脂平板培养基上挑选单个白色菌落接种到3 mL含有氨苄青霉素的液体培养基中，37 ℃培养12 h；取出3 mL培养菌液，12 000 r/min离心2 min，弃上清液；用250 μL Solution Ⅰ 悬浮细菌沉淀；加入250 μL SolutionⅡ 裂解细菌；加入350 μL SolutionⅢ，混匀，直至形成凝集块，室温12 000 r/min离心10 min，弃滤液；将上清液转移至离心柱，12 000 r/min离心1 min；将500 μL的BufferWA加入离心柱，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；将700 μL BufferWB加入离心柱，12 000 r/min离心30 s，弃滤液，再重复该步骤；将离心柱安置于收集管上，再离心，除尽残留液体；将离心柱安置在1.5 mL离心管上，将50 μL Elution Buffer加到离心柱膜中央，静置1 min，12 000 r/min离心1 min，洗脱DNA。

1.10 扩增目的DNA

用前面所述的引物，采用优化的PCR法，从重组质粒DNA中扩增目的DNA片段，进行凝胶电泳，收集目的DNA片段，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 IL-18核苷酸序列测定结果 从剑河白香猪脾脏组织细胞提取总RNA，然后使用反转录、PCR法、电泳，通过凝胶成像仪观察检测表明，退火温度在55 ℃时，约在580 bp处出现明显的基因条带，而退火温度在53、57、59 ℃时，在580 bp处无基因条带，因此，适宜的退火温度为55 ℃。

2.2 IL-18基因质粒构建、序列测定分析 剑河白香猪IL-18 DNA经回收后，与pMD19-T Vector的外源基因插入位点连接，再转化DH5a后，挑选单个白色菌落，在含有氨苄青霉素的液体培养基中培养，提取重组质粒DNA，再进行PCR电泳，约在580 bp处出现特异条带（图1）。