湖南金丝皇菊花叶病害病原物鉴定

中图分类号：S682；S432 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2025）06-0090-06

引用格式：，等.湖南金丝皇菊花叶病害病原物鉴定[J].湖南农业科学，2025（6）：90-95.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.006.016

Identification of Pathogens Causing Mosaic Disease of Chrysanthemum morifolium 'Jinsi Huangju' in Hunan Province

HOU Jia-yi ^1，2，3 ，LI Ling'，CHEN Xue-feng1，WU Bo-shun1，XIANG Li-li1，2³，YU Xiao-ying ^1，2，3 ， XU Lu12.：

（1.Colegeoficuue，aricalUstsh，;.ndropalQality andUtilizationeinoeahntegh8C;3esnbratorygsha）

Abstract：To identifythe pathogens causingtypical mosaicdiseaseofChrysanthemum morifolium'Jinsi Huangju’inHunan，we colected the leaves withmosaic diseasesymptoms from the Hongcichrysanthemum plantingbase.RT-PCRamplification，enzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA），andnegativestaining electronmicroscopywereemployedtoidentifythepathogensithee dimensions ofucleotide sequence，morphology，and protein specificity.RT-PCRamplifcationofthediseased leaves producedtwo targetbands，which wereat thesizessimilartothetarget gene lengthsofchrysanthemum chlorotic motleviroid（CChMVdand chrysanthemum virus B（CVB）.ELISA confirmed the presenceof CVB-specific protein in the diseased leaves.Negative staining of the suspension preparedwiththediseasedleavesrevealedpathogencomponentintwodiferentshapes，whichweresimilarto morphologicalstructureofCChMVdandCVB.Thephylogenetic treeshowcasedthattheisolate（viroid）fromHunansharedthesame clade with four reference isolates （e.g.， CChMVd，FJ647546.1） from Spain， with the sequence similarityof 87% .In addition， the isolate （virus）fromHunansharedthe sameclade withthat fromNanjing （CVB，JQ904595.1），withthe sequencesimilarityof 100% .In conclusion，CChdandCBarethepathogenscausingmosaicdiseaseofC.morifoliumJinsiHuangju'inHunan，andteobied infection of the two viruses leads to the occurrence of this disease.

Key Words：Chrysanthemum morifolium'Jinsi Huangju'; virus identification; CChMVd; CVB; RT-PCR

金丝皇菊（Chrysanthemummorifolium'JinsiHuangju'）为药食兼用型大花茶菊，不仅富含黄酮类、多糖和氨基酸等多种药用活性成分，还极具观赏价值[1-3]。随着国家乡村振兴战略的深人实施，金丝皇菊在湖南部分县域地区已经实现了规模化种植，成为当地农业特色支柱产业。由于金丝皇菊的规模化种植主要依赖无性繁殖，易导致病毒和类病毒积累，引发花叶、褪绿斑、分枝减少、不现蕾和不开花等症状，严重时整株枯死，造成种质退化和产量下降等问题[4-5]。菊花极易受到病毒和类病毒侵染，目前全球已报道的侵染菊花的病原体超过20种，包括菊花B病毒[ChrysanthemumvirusB（CVB）]、烟草花叶病毒[Tobaccomosaicvirus（TMV）]、番茄花叶病毒[Tomatomosaicvirus（ToMV]、番茄不孕病毒[Tomatoaspermyvirus（TAV）]、菊花褪绿斑驳类病毒[Chrysan-themumchloroticmottleviroid（CChMVd）]、菊花矮化类病毒[Chrysanthemumstuntviroid（CSVd）]等。这些病原体引发的病害在我国多个菊花主产区频繁发生，严重制约着产业的可持续发展[。近年来，湖南部分种植区的金丝皇菊出现了花叶症状，导致产区菊花产量和品质降低，而关于其病原物鉴定的研究尚未见报道。因此，采用高效、快速的检测方法确定湖南金丝皇菊花叶症状的病原物种类，对当地菊花病害的精准防控、产量品质提升及抗病种质筛选均具有重要意义[7-9]。当前，植物病毒及类病毒病原鉴定方法主要包括逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）[10-12]、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）[13]和酶联免疫吸附法（ELISA）[14]等。其中，qRT-PCR需使用精密荧光定量PCR仪，存在设备成本投人高、RNA提取技术要求高和操作复杂等问题；相比之下，RT-PCR对设备要求低、操作简单且成本低廉，适用于病原物的快速初筛和常规检测；ELISA法用于植物病毒检测具有灵敏度高、应用范围广、特异性强、设备自动化程度高和成本较低等优势，其与分子检测方法（如RT-PCR/qRTPCR）结合使用时可形成优势互补[15-16]。

研究以湖南洪慈菊花种植基地内出现花叶症状的金丝皇菊植株病叶为试验样本，通过RT-PCR扩增测序、负染色电镜观察法和酶联免疫吸附法，从核酸序列、形态结构及蛋白质特异性3个维度明确导致金丝皇菊花叶病害的病原物种类，以期为当地金丝皇菊种植产业的可持续发展提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

调查显示，发病植株呈现明显的病害感染症状，具体表现为：老叶呈紫红色病变，紫红色由叶片顶端向叶柄蔓延，花后病状加重，病变范围覆盖全株叶片，部分叶片伴随坏死斑（图1A、D）；花瓣边缘同样呈现紫红色晕染且花朵畸形（图1B）；新叶脉间褪绿，脚芽新叶感病症状尤为明显（图1C、E、F）。供试材料于2020年春季采集自湖南省醴陵市茶山镇洪慈菊花规模种植基地，选取呈现花叶症状的15株金丝皇菊植株，采摘病叶样本置于无菌无酶 50mL 离心管中，冰上暂存后液氮速冻，于 -80^∘C 冰箱中保存。检测于2020年5月至2021年5月在内完成。

1.2 试验方法

1.2.1RT-PCR检测采用RNA提取试剂盒TRIGeneReagent（GenStar）提取病叶样本总RNA，经cDNA反转录试剂盒TransScript？FlyFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix（TransGenBiotech）将其反转录成cDNA，置于 -20^∘C 冰箱保存备用。基于NCBIGenBank中收录的5种病原体（CVB、CChMVd、TAV、ToMV、TMV）的特异性目的片段，利用PrimerPremier5.0软件进行引物设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司（以下简称生工生物）合成5对特异性引物（表1。以cDNA为模板进行扩增后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2RT-PCR产物的克隆测序与分析使用PCR产物纯化试剂盒B518141-0050（SangonBiotech）纯化RT-PCR产物，得到目的DNA片段。利用第二代TOPO克隆试剂盒C601-01（Vazyme）将提纯的目的DNA连接到T载体上，重组质粒。将重组后的质粒转入 DH5a 感受态细胞中，吸取转化后的菌液均匀涂布于含 100μg/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基中进行筛选，于 38^∘C 培养 12～18h ，挑取4个饱满的白色单菌落，接种至预先制备的LB液体培养基（含氨苄青霉素 100μg/mL ）， 38^∘C 、 200r/min 振荡培养 12～18h ，抽取 400μL 菌液送至生工生物测序。1.2.3负染色电镜观察法取新鲜金丝皇菊病叶 10g 参照韦石泉等[的方法制备悬浮液，置于 2mL 离心管中， 4^∘C 避光封存。参照王学东等[18]的方法直接进行负染色体制样，将制备的样本置于电镜（FEITecnaiG2Spirit）中观察。

1.2.4酶联免疫吸附法参照何咏怡等[19的方法调整试验条件，取1g金丝皇菊病叶于液氮速冻研磨成粉，加入 9mL 磷酸缓冲液（ 0.01molL，pH 值7.2＼～7.4）研磨匀浆，将匀浆液分装至 2mL 离心管中， 4000r/min 离心 15min ，取上清液按CVB酶联免疫分析试剂盒（CB12257-Pt，COIBOBIO）说明书进行操作，测定完成后分析结果。设置空白对照组、阳性对照组和阴性对照组。若阳性对照组OD值 >0.8 ，阴性对照组OD值 <0.2 ，则试验结果有效；判断阈值 Σ=Σ 阴性对照OD值 +0.15 ，若试验组OD值 > 阈值，则试验结果为阳性；若试验组OD值 < 阈值，则试验结果为阴性。

1.2.5系统发育分析将克隆测序结果与NCBI数据库进行比对，采用Neighbor-Joining法在MEGA11软件中构建系统发育树，通过Bootstrap检验（1000次重复）评估节点支持率，分析目标序列的亲缘关系。

1.3 数据处理与分析

使用Excel2017进行数据统计、整理和计算分析；使用MEGA11软件绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测结果

RT-PCR检测结果如图2所示，金丝皇菊病叶样本中扩增出2条目的条带，其特异性扩增片段大小约为250和 750bp ，分别与CChMVd和CVB的目的基因片段长度相近。此外，未检测到其他目标病毒（类病毒）的特异性目的条带，初步证明金丝皇菊样本中存在CChMVd和CVB的复合侵染，

2.2 酶联免疫检测结果

金丝皇菊病叶样本的ELISA检测结果显示，空白对照组、阳性对照组和阴性对照组的OD值分别为0.044、1.301和0.084，均在标准范围内。CVB检测的OD值为0.269，大于阈值（0.234），检测结果为阳性。酶联免疫检测结果证实供试样本中存在CVB的特异性蛋白结构。