一株耐低温抗盐碱异养硝化菌株CS-6的除氮特性研究

中图分类号：X172 文献标志码：A 文章编号：1004—6755（2025）07-0017-04

Denitrogenate characterization studies by a strain of heterotrophic nitrifying bacteria CS-6 resistant to low temperature resistant and salt alkali resistant *

JIANG Wenwen1， TIAN Xiangli²，WANG Guodong1，GUO Enmian1 ， XIN Zhaozhe1，TAN Jiabo1 （1.School of Marine Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266lo9，China; 2.Fisheriescollege，OceanUniversityof China，Qingdao 266oo3，China）

Abstract：Low temperature，high salinityand other environments conditions willaffect the nitrification activity of microorganisms and reduce the removal of ammonia nitrogenand nitrite nitrogen inwater.A heterotrophic nitrifying bacterium CS^-6 was isolated from the biofilters of coldwater fish recirculating aquaculture system and identified as Bacillus by 16S rRNA. The nitrogen removal characteristics of the later were studied. The results show that Strain CS ⋅-6 can achieve removal rates of 100% and 91.67% for ammonia nitrogen and nitrite nitrogen，respectively，within 72 hours.The removal rates for ammonia nitrogen and nitrite nitrogen can reach up to 100% and 99% ， respectively，at low temperatures of 15^∘C ，salinity ranging from 0‰ to 50‰ ， and pHlevels between 6 and 9. This indicates excelent cold resistance and salt一tolerance properties，demonstrating that Strain CS -6 has high water purification efficiency and broad application potential.

Key words：low temperature;halo一alkali tolerance;heterotrophic nitrifying bacteria;aquaculture water treatment

水产养殖活动产生的残饵以及养殖动物的排泄物会导致养殖水体中的氨氮和亚硝酸氮升高[1]，高浓度的氨氮和亚硝酸氮会对养殖动物产生毒害[2]，因此，有效降低养殖水体中的氨氮和亚硝酸氮，维持良好的养殖水质环境，是保证养殖安全的基本要求。

生物除氮因具有无二次污染、无残留等特点，成为目前水产养殖中广泛应用的除氮方法之二[3]。异养硝化细菌因可以有效去除水体的氨氮和亚硝酸氮，近年来被广泛研究[3]。通常硝化过程的最适温度为 ，温度降低会导致硝化效率随之下降。但对于许多冷水鱼类如大西洋鲑鱼（Salmosalar）、大菱鲆（Scophthalmusmaximus）等，养殖温度在 16^∘C 左右[5]，常导致许多异养硝化细菌无法充分发挥硝化活性，影响对水体氨氮和亚硝酸氮的控制。另外，许多异养硝化细菌对盐度、pH值等变化敏感，也会影响硝化性能[6。因此，筛选耐低温、适应盐碱变化的异养硝化菌株显得尤为迫切。

本研究从冷水鱼循环水养殖系统生物滤池中分离筛选出一株异养硝化菌株，通过对其进行除氮特性检测，发现菌株具有较高的硝化特性，并且对低温和高盐碱条件均具有良好适应性。研究结果对于丰富异养硝化菌种资源库，并为未来该菌株在实际养殖过程中的开发和应用提供了重要的科学依据。

1材料与方法

1.1 菌株来源

用于进行菌株筛选的样品取自山东省日照市冷水鱼循环水养殖系统生物滤池的生物滤料。

1.2 培养基

富集培养基：1g KNO₂ ， MgSO₄ 0.1g， .2H₂O0.26g，K₂HPO40.5g，CaCO₃ 1g FeSO₄ ： 7H₂O 0.183g ，葡萄糖 0.3g ，酵母膏0.03g ，蒸馏水 1000mL 。

分离培养基：1g KNO₂ ， MgS₄ 0.1g， ： 2H₂OO.26g，K₂HPO₄O.5g，CaCO₃ 1g ，FeSO4. 7H₂O 0. 183g ，葡萄糖 0.3g ，酵母膏0.03g ，琼脂粉 15g ，蒸馏水 1000mL 。

氮基础降解溶液： 1.575g 葡萄糖， 0. 053 5g ΔNH₄Cl 0.069gNaNO₂，0.085gNaNO₃，1000mL 蒸馏水。

1.3 菌株分离与鉴定

取生物填料 2g ，以震荡方式洗脱填料上的生物膜制得菌悬液。按照 10% 的体积比将菌悬液接种到富集培养基中，于 15°C，160r/min 的条件下培养富集。富集结束后涂布于分离培养基中培养，挑取单菌落在分离培养基上划线纯化。纯化后的菌株接种至氮基础降解溶液中，筛选出具有较高无机氮去除能力的菌株 CS^-6 。

菌株 CS^-6 采用水煮法提取DNA，使用27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）

通用引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至青岛擎科天成生物技术有限公司进行测序分析。

1.4菌株 cos-6 对不同形态氮的去除能力测定

将处于对数生长期的菌株 CS-6 调整菌液浓度为 10⁶ 后，按照 10% 的接种比例接种至氮基础降解溶液中，在 15^∘C ，转速为 160r/min 条件下，间隔 24h 取样，连续测定 ^120h 内氨氮（NH₄⁺-N） 、亚硝酸氮、硝酸氮和总氮的浓度，计算去除率。总无机氮的浓度为氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮浓度之和。

1.5不同环境条件对菌株CS-6氨氮和亚硝酸氮去除能力及生长的影响

分别研究不同温度、盐度和 ΔpH 值条件下对菌株 CS^-6 的生长性能及其氨氮和亚硝酸氮去除能力，每个处理设置3个重复。温度分别为10%15%.20%.25%.30%.35% ;盐度分别为 0‰ 、 10‰ 、 20‰ 、 30‰ 、 40‰ 、 50‰ pH 值分别为6、7、8、9。

试验前，先将菌株 CS^-6 预培养至对数生长期，调整菌液浓度为 10⁶ ，然后按照 10% 的接种比例接种至降解液中。在试验的第0天和第3天测定不同处理条件下降解溶液中的氨氮和亚硝酸氮浓度以及细菌的生长情况 （OD₆₀₀ ），并计算去除率。

1.6 测定方法

氨氮采用靛酚蓝法测定，亚硝酸氮采用重氮一偶氮光度法测定，硝氮依据Schnetger等[7]的方法进行测定，总氮采用消解法测定，细菌的OD₆₀₀ 值使用酶标仪SYnergy²测定。

1.7 数据处理

将所测得的PCR产物序列与NCBI中已登录的 序列进行核昔酸同源性比较，使用MEGA7.0软件构建菌株的系统发育树。

去除率的计算公式如下：

n=（C₀-C_n）/C₀×100%

式中： n 为去除率， %;C₀ 为初始的氮浓度，mg/L;C_n 为试验结束时的氮浓度， mg/L 。

试验数据使用SPSS23.0.0进行单因素方差分析（ANOVA），再使用Duncan检验进行均值的多重比较，以 P<0.05 为差异显著水平。试验数据采用Origin9.1软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1菌株CS-6的鉴定结果

筛选得到的菌株CS一6的菌落为乳白色，圆形，表面光滑凸起，边缘整齐，易挑起。经16SrRNA序列比对后鉴定为芽孢杆菌（Bacillussp.），见图1。

2.2菌株CS-6对不同形式氮的去除效果

将菌株 CS^-6 接种到基础氮降解溶液后，在试验期间，对氨氮和亚硝酸氮均有显著去除效果，最高去除率分别为 100% 和 91.67% ，见图2。在试验的 ^48h ，氨氮的去除率达到 100% ，亚硝酸氮的去除率达到 91.67% ，并一直持续至试验结束。菌株 CS^-6 对总无机氮的去除率在第 48～96h 达到最高，为 28.46% 。