牛筋草原生质体分离条件的研究

中图分类号：Q943.1 文献标志码：A 文章编号：1003-935X（2025）02-0031-08

Isolation Conditions of Protoplasts in Eleusine indica

CUI Xinyu ^1，2 ， JIANG Hao ^1，2 ， TIAN Xingshan ¹ ， ZHANG Chun1 （1.Plant Protection Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of New Techniques for Plant Protection in Guangdong，Guangzhou 51O640，China; 2.School of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 51O631，China）

Abstract：The isolation and cultivation of high-viability plant protoplastsserveas the foundation for studying plant physiology，biochemistry，andmolecularbiologyatthecellularlevel.However，duetothepresenceofacellwall surrounding plant protoplasts，thereare numerouschallnges in their isolationandculture.Inthisstudy，usingleaves andsheaths of the globall invasive weed Eleusine indicaas materials，single-factor experiments were conducted to optimize the conditions for protoplast preparation from E .indica，including material quantity，enzyme solution composition，enzymatic hydrolysis time，and centrifugation speed.High-activity protoplastsof E .indica were successfully obtained.Specifically，2 gof leaves from E .indicaplants at 5-6 leaf-stage were enzymatically hydrolyzed for 3 hours in a 10mL enzyme solution containing 1.0% cellulase， 0.5% macerozyme，and 0.5% pectinase.The protoplasts were then collected by centrifugation at 2 500r/min .The maximum protoplast yield reached 2.075× （204号 （204 10⁷ protoplasts/ g ， with over 90% viability.Furthermore，the yield of protoplasts prepared from leaves was higher than that from sheaths. This study established an optimized method for preparing protoplasts from E .indica leaves，laying the groundwork for studying the herbicide resistance mechanisms of E .indica at the single-cell level and providing a reference for the preparation of protoplasts from other grass weeds.

Key words： Eleusine indica ; protoplast; enzymatic hydrolysis ;single - cell sequencing

近年来，单细胞测序技术（scRNA-Seq）在生物医学领域得到广泛应用，但植物单细胞测序进展缓慢，难点之一是植物原生质体的分离与稳定培养。scRNA-Seq已在少数植物物种中得到证实，包括模式植物（如拟南芥）、农作物（如水稻）和生物能源作物（如杨树）等[1]。Wang等利用scRNA-Seq技术阐明了茶叶中儿茶素酯代谢的复杂发育调节机制，挖掘出茶叶独特味道的来源[2]；Liu等利用scRNA-Seq技术揭示了花生叶片分化发育轨迹[3]。目前国内外研究者从分子水平和组织水平开展了杂草抗药性机制研究，如Pan等利用转录组测序技术（RNA-Seq）发现了光头稗（Echinochloacolona）对草甘麟的非靶标抗性新机制[4]。笔者所在研究团队利用基因组学技术，揭示了牛筋草中草甘麟靶基因复增驱动牛筋草抗草甘麟的新机制[5]。但传统的分子和组学技术不足以揭示植物复杂性背后的特定细胞类型的分子机制;通过scRNA-Seq等新型生物技术，从单细胞水平研究杂草抗药性机制的研究尚未见报道，主要制约因素之一是高质量植物原生质体的制备较难。除草剂的长期大量使用导致杂草抗性种群发生与发展，给农田杂草防控带来极大挑战。杂草抗性机制研究是科学防控农田杂草的前提。目前国际上杂草抗性机制研究主要集中在分子和组织水平。因杂草原生质体分离和培养技术不够成熟，除草剂胁迫下杂草细胞层面上的活动鲜有研究。

植物原生质体是指除去细胞壁，由质膜包裹着的裸露细胞。酶解法是原生质体制备的常用方法，水稻、玉米和烟草等作物已有较成熟的原生质体分离体系，覆盖到发育的不同阶段[6。但由于不同植物的细胞壁组分不完全相同，因此不同植物原生质体提取和培养条件也不相同，甚至同一植物的酶解条件并不适用于所有品种。Jenes等以44种基因型水稻为材料，仅有20种基因型水稻品种成功分离到原生质体[7]。植物叶子、根、愈伤组织等均可用于制备原生质体，原生质体含有完整的遗传物质，是研究植物生长调节、代谢以及响应外界胁迫生理过程的有力材料，还可用于遗传转化、基因瞬时表达、亚细胞定位等试验的研究。利用模式植物拟南芥叶肉原生质体已开展了多种激素信号通路以及非生物和生物胁迫应激信号通路等分子研究[8]。赵小强利用早熟禾原生质体开展了体细胞杂交研究[。唐然等优化了华南象草和菊花花瓣等原生质体的分离条件，并利用原生质体建立了瞬时转化体系，用于基因工程和分子育种等研究[10-11] 。

牛筋草［Eleusineindica（L.）Gaertn.]是一年生禾本科穆属植物，是一种全球性的农田恶性杂草，在我国广泛分布，尤其在华南地区发生危害严重[12]。本研究以牛筋草为材料，拟探明牛筋草原生质体制备的最佳酶解条件，包括材料用量、酶液组分、酶解时间和离心速率等，比较优化后的酶解条件对牛筋草叶鞘和叶组织原生质体的提取效果，从而建立一种高效的牛筋草原生质体制备体系。旨在建立一种全球性恶性杂草牛筋草原生质体的制备方法，以期为从单细胞水平研究牛筋草相关科学问题提供技术支撑，也为其他禾本科杂草原生质体的制备提供参考。

1材料与方法

1.1 供试材料

供试牛筋草由广东省农业科学院植物保护研究所杂草研究室提供

1.2试剂配制与原生质体分离

1.2.1 酶解液的制备 主要试剂：纤维素酶RS、离析酶R-10、果胶酶Y-23均购自日本YakultHonsha公司;2-（ N- 吗啡啉）乙磺酸（MES）、甘露醇、牛血清蛋白（BSA） ，NaCl，KCl，CaCl₂ 、巯基乙醇等生化试剂均购自于Solarbio公司。试验所用W5溶液的配制：154mmol/LNaCl、125 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L MES（ pH 值5.7），用KOH将 pH 值调至5.8；在高压灭菌锅 0.1MPa.121.3^qC 条件下灭菌10～30min 。酶解液配制： 0.6mol/L 甘露醇、10 mmol/L MES、0. 1% BSA、1 mmol/L CaCl₂ 、5 mmol/L β- 巯基乙醇。

酶液配制：称量 _1.092g 甘露醇和 0.0195g MES加入水中；用容量瓶定容至 10mL ，将该溶液转移至 10mL 烧杯中；清洗 pH 计，用1mol/LKOH调节 pH 值至5.7；继续加人 _0.1g 纤维素酶RS，0.05g 离析酶R-10和 0.05g 果胶酶Y-23（以上步骤全部在磁力搅拌器上进行，待溶液澄清后用保鲜膜封口）；在 55^qC 水浴锅中水浴 10min ；室温（ 25°C ）放置使酶液温度降至室温；继续加入0.01gBSA，10μL 1mol/LCaCl₂ 母液， 7μL 巯基乙醇。搅拌 10min 以上，避光保存，若多次使用可分管保存至 -20^∘C 冰箱。冻存的酶液重新解冻后，在磁力搅拌器上充分搅拌，直至白色沉淀完全溶解，待用。

1.2.2原生质体的分离参照油莎豆原生质体的分离方法[13]，利用酶解法分离牛筋草原生质体，主要步骤如下：（1）从5～6叶期的牛筋草植株上剪下叶片 1～2g 。吸取 2mL 预冷的 0.6mmol/L 甘露醇溶液浸泡，用刀片将叶片切成 1mm 的细段，尽量一刀切碎不要反复切割，避免细胞受到损伤。将其转移至预冷的 0.6mmol/L 甘露醇溶液中，避光放置 10～20min 。（2）吸弃甘露醇，加入10mL 酶解液，用封口膜密封，在 28°C70r/min 摇床中避光酶解 ³h 。（3）用300目的细胞过滤器过滤酶解液。（4）将滤液贴壁移至圆底离心管，室温下 1500r/min 离心 10min 。（5）小心取出离心管，轻轻吸弃上清液。加入 3mL W5溶液到离心管中，上下缓慢颠倒混匀， 1500r/min 离心 10min 。（6重复“步骤（5）"1次，至上清液变明亮。将原生质体溶于 1mL W5溶液中，置于冰上避光保存。

1.2.3原生质体的观察与计数采用血球计数板对牛筋草原生质体产量进行检测。吸取少量纯化后的原生质体悬浮液于血球计数板上，在显微镜下观察计数，统计原生质体的产量，重复3次。计数时一定要保持显微镜载物台水平，不能倾斜，逐次计算中央大方格内25个中方格里的原生质体。计数规则为记上不计下，计左不计右。然后再根据下式求出 1mL 悬浮液中原生质体的数量：1mL 悬浮液中的原生质体数量 μ=1σ 个大方格0 （0.1mm³ ）悬浮液中的原生质体数 ×10⁴ 。之后再根据每个处理组提取液的体积计算总原生质体数量，然后根据材料用量计算得出 1g 材料（如叶片）所能提取的原生质体数量。

1.2.4原生质体活力的测定采用荧光素二乙酸酯（fluoresceindiacetate，FDA）对原生质体的活力进行染色鉴定。FDA用丙酮配制成 5mg/mL 溶液，然后取 500μL 原生质体悬浮液，加入 5μL 5mg/mL FDA，轻轻混匀后染色 10min 。取 10μL 在荧光显微镜下检测其活力，用血细胞计数板观察计数。同一视野范围内荧光条件下统计绿色荧光的原生质体数量（有活力）以及白光条件下统计原生质体总数量，随机选择10个视野。每个样品3次技术重复。原生质体活力计算公式如下：原生质体活力 Σ=Σ 绿色荧光的原生质体数量/原生质体总数 ×100% 。