医学研究生实验设计能力培养

［摘 要］ 随着我国医学领域的高速发展，对于具备扎实理论基础和卓越实践能力的医学人才的需求日益凸显。在这一背景下，基础性实验教育作为培养医学研究生科研能力和创新思维的重要途径，其重要性不言而喻。然而，医学研究生在面临繁重的课业、临床实习以及实践任务时，往往难以抽出足够的时间和精力来系统学习和开展基础实验研究。因此，在新医科教育模式的引领下，我们需要探索更为高效、实用的基础实验教学方法。研究立足于当前医学研究生的实际情况，通过具体的实验教学实践，提出了一套富有创新性且贴近临床实际的基础实验课题设计与实施案例。这一案例不仅为医学研究生提供了一个可供参考的基础实验研究新思路，更为他们应对当前医学教育面临的新挑战提供了有力的支持。

［关键词］ 基础实验；医学研究生；科研能力；实践；案例

［基金项目］ 2022—2026年武汉大学中南医院科研基金项目“DNA聚合酶POLD1促进膀胱癌发生发展及重塑免疫微环境的功能和机制研究”（SWYBK03）

［作者简介］ 曹馨月（1988—），女，湖南长沙人，硕士，武汉大学中南医院生物样本库科研助理，主要从事泌尿系统肿瘤研究肿瘤学、生物样本科学研究；余梦雪（1995—），女，湖北仙桃人，硕士，武汉大学中南医院生物样本库、泌尿系统疾病湖北省重点实验室助理实验师（通信作者），主要从事肿瘤精准诊疗的应用转化、泌尿系统肿瘤研究。

［中图分类号］ G643.0 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1674-9324（2024）52-0001-06 ［收稿日期］ 2024-05-24

基础性实验教育在我国医学人才的培养体系中占据举足轻重的地位，是塑造高素质医学人才的关键环节之一［1］。通过系统的基础性实验教育，医学研究生能够更深入地理解疾病的发病机制，掌握科学研究的方法，为未来的临床实践和科研工作奠定坚实的基础。然而，当前的医学研究生往往面临着课业繁重、临床教育及实践任务繁重的挑战，这使得他们难以投入足够的时间和精力进行系统性学习和开展基础实验。鉴于这些现状，我们有必要在医学研究生基础实验教学过程中引入更多可切实开展的实验类研究，以帮助他们更好地掌握实验技能，提高综合素质。本文致力于结合在实验教学实践中的具体体会，以一个具有代表性的基础性实验课题为例，详细阐述其设计与实施过程，并针对其中存在的问题提出切实可行的建议，为医学研究生的基础实验教学提供有益的参考。

一、选题立项

医学研究生在开展基础研究时，提出科学问题是一个至关重要的环节。科学问题应来源于临床实践或理论研究的实际需求，确保问题的实际应用价值。同时应广泛了解所研究领域的前沿动态，确保问题的新颖性和创新性。以笔者团队所在的泌尿系统疾病湖北省重点实验室的研究重点膀胱癌为例。膀胱癌（Bladder cancer， BLCA）发病率居男性恶性肿瘤的第四位，2024年预计美国约有膀胱癌新发病例83 190例和死亡病例16 840例［2］。在我国，最新统计2022年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.58/10万，其中男性膀胱癌发病率居全身恶性肿瘤第八位，女性亦排在第十位以后［3］。大约有5%的患者初诊为转移性膀胱癌，约30％的患者初诊为肌肉浸润性膀胱癌（Muscle invasive bladder cancer， MIBC），其中一半最终会发生转移［4］。约70%的患者在初诊时为非肌层浸润性膀胱癌（Non-muscle invasive bladder cancer， NMIBC），15%～30%患者会发展成为MIBC；并且，50%～70%的患者经过治疗后会复发，膀胱癌一旦发生肌层浸润，将直接威胁患者生存［4］。目前针对MIBC比较有效的治疗方法是手术和放化疗等综合治疗，但会导致患者的生存质量下降［5］。MIBC的预后差与肿瘤细胞的快速生长、高浸润性等密切相关，但分子机制尚未明确［5］。因此，明确阐明膀胱癌发生发展过程中的分子作用机制对膀胱癌的诊断和治疗都具有十分重要的临床价值。长非编码RNA（long non-coding RNA， lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，目前的研究表明lncRNA具有调节基因表达的功能，其在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用，亦是肿瘤研究的热点问题［6］。然而，关于lncRNA在膀胱癌发生发展过程中的调控作用尚不明确，因此筛选表达异常水平的lncRNA作为膀胱癌可靠的生物标志物可能具有较大潜力。这部分主要分析了膀胱癌与lncRNA的研究现状，为即将开展的基础性实验课题提供一个可靠的立项依据，展示课题的科学价值、创新性和可行性。

二、分子标志物的筛选及验证

这部分将具体实施这项实验课题，从膀胱癌患者的临床样本出发，利用高通量测序技术检测肿瘤组织与对照样本中lncRNA的表达水平，对获得的数据进行深入分析，筛选出发生特异性改变的lncRNA，并基于这些初步发现筛选，通过验证确定一系列候选lncRNA，为后续的机制研究奠定基础。

1.初步验证。在临床采集的3对膀胱癌和正常膀胱上皮组织中，通过lncRNA芯片筛选，发现LINC00393在膀胱癌组织中显著上调（见图1A）。

2.进一步验证。在临床采集的50对膀胱癌样本中，对LINC00393的表达水平进行qRT-PCR检测。结果显示，LINC00393在膀胱癌中的表达水平显著升高（见图1B），这一发现进一步证实了LINC00393与膀胱癌之间的关联。

3.初步研究。通过绘制Kaplan-Meier生存曲线，可更直观地展示LINC00393对膀胱癌患者生存期的影响。结果显示，LINC00393低表达的患者相比高表达的患者具有更长的生存期（见图2A），这进一步强调证明了LINC00393在膀胱癌中的重要性。同时，发现LINC00393的表达水平与SIRT1 mRNA表达水平呈正相关（R=0.608，p＜0.001）（见图2B），这一发现提示LINC00393可能通过调控SIRT1的表达来影响膀胱癌的发展。最后，通过下调LINC00393的表达实验，检测观察其对膀胱癌细胞T24增殖能力的影响。结果显示，下调LINC00393后，膀胱癌细胞T24的增殖能力受到抑制，且SIRT1 mRNA和蛋白水平也明显下降（图2C-D）。这一发现不仅进一步证实了LINC00393与SIRT1的关系，也为后续的机制研究提供了方向。公共数据库分析：使用The Cancer Genome Atlas（TCGA）中408例膀胱癌样本测序数据进行GSEA通路富集分析，发现LINC00393的高表达明显富集到PPAR信号通路；进一步提取TCGA数据库中408例膀胱癌测序样本的基因表达信息，分析发现LINC00393和SIRT1表达量呈显著的正相关关系（具体结果未展示），这与图1的筛选结果一致，再次验证了LINC00393在膀胱癌中的重要角色。（A）50例膀胱癌病人的Kaplan-Meier生存曲线显示LINC00393与病人的总生存期负相关；（B）膀胱癌组织中LINC00393与SIRT1 mRNA表达水平的相关性分析（R=0.608，p＜0.001）；（C）膀胱癌细胞T24中干扰LINC00393后，MTT结果显示细胞的增殖能力下降；（D）膀胱癌细胞T24中干扰LINC00393后，SIRT1 mRNA和蛋白水平下降。

三、基于所筛选、验证的生物标志物的机制研究

在膀胱癌组织中完成所筛选的生物标志物验证后，进一步的机制研究需要采用膀胱癌细胞系模型进行基因操作，以便进行后续的表型检测和机制研究（具体结果未展示）。首先，在膀胱癌细胞中利用生物素标记的RNA探针对LINC00393进行标记，随后通过链霉素磁珠进行RNA pulldown实验，最后通过蛋白质电泳结合质谱检测技术确定LINC00393的相互作用蛋白PPARg。鉴于有文献报道PPARg可以抑制SIRT1的转录［7］，同时在前期的实验中也发现LINC00393和SIRT1的表达存在显著的正相关关系。因此推测LINC00393可能通过与PPARg的结合来调控SIRT1的转录活性。为了验证这一假设，可在后续的研究中围绕LINC00393/PPARg/SIRT1信号调控轴展开更深入的探讨实验研究（具体结果未展示）。这一研究将为更全面地理解膀胱癌的发病机制提供新的视角和线索。

四、研究范例的讨论及总结

基于该研究范例，可从以下几个方面进行讨论。

1.SIRT1的累积促进肿瘤的发生发展。SIRT1参与多种生物学过程并起着至关重要的作用，如细胞周期的调节、DNA修复和应激状态下的细胞生存等［8-13］。此外，SIRT1在多种肿瘤中异常表达，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等，推测SIRT1可能在肿瘤的发生过程中起到重要的作用［14-16］。有研究表明，SIRT1直接结合并去乙酰化p53、FOXO1、FOXO3和E2F1等转录因子，调控疾病进展［14-20］。前期研究发现，膀胱癌中SIRT1的表达上调，干扰SIRT1后抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭，表明SIRT1通过去乙酰化FOXO3a促进膀胱癌细胞的增殖和迁移［21］。基因表达主要是通过转录和转录后水平进行调节。研究表明，SIRT1在癌细胞中的过表达主要发生在转录水平，SIRT1基因启动子中的两个p53结合位点通常抑制SIRT1基因转录，肿瘤抑制因子HIC1与SIRT1形成转录抑制复合物，直接结合SIRT1启动子并抑制其转录［22］。此外，在细胞应激或DNA损伤下，细胞周期和凋亡调节因子E2F1通过结合SIRT1启动子直接诱导SIRT1转录［17］。lncRNA也被发现参与SIRT1的调节，其中竞争性内源RNA方式是目前研究最多的调控方式，例如，lncRNA HNF1A-AS1可通过内源竞争结合miR-34a诱导SIRT1表达从而促进结肠癌的转移［23］。该讨论部分表明，SIRT1的转录和转录后调控是其在肿瘤中异常表达的重要方式，SIRT1受lncRNA调节的其他机制目前未见报道。

2.转录因子PPARg参与SIRT1转录调控与膀胱癌密切相关。有研究表明，PPARg在多种肿瘤组织中高表达，其中包括膀胱癌。Yang等［24］通过荧光原位杂交技术检测显示，膀胱癌组织中PPARg表达量明显高于癌旁组织，此外，与浅表性膀胱癌样本相比，浸润性膀胱癌组织中PPARg表达水平明显更高。PPARg特异性激动剂罗格列酮能够促进膀胱癌细胞的增殖［24-25］，提示PPARg的高表达或激活均能促进膀胱癌的发生进展。SIRT1是PPARg的重要调控靶点之一，PPARg蛋白可结合到SIRT1基因的启动子区域，从而抑制SIRT1基因的转录［7］。同时，SIRT1也可以结合到PPARg启动子区域抑制其转录，由此形成一个负反馈和自我调节的环路［26］。

3.LINC00393诱导转录因子PPARg结合促进SIRT1转录lncRNA通过多种机制进行转录水平调控，其中研究最多的是内源竞争结合miRNA，通过转录后调节基因的表达。例如，lncRNA HNF1A-AS1可通过内源竞争结合miR-34a诱导SIRT1表达从而促进结肠癌的转移［23］。lncRNA也可以直接与蛋白结合发挥功能，例如lncRNA结合RNA结合蛋白TLS来调控蛋白CBP和p300的组蛋白乙酰转移酶活性，进而抑制Cyclin D1的转录［27］。lncRNA Evf2能够激活转录因子DLX2，进而调控基因转录［28］。lncRNA也能够结合转录因子，通过调节转录因子结合启动子的能力，促进或抑制相应基因的表达。比如，Luo等［29］研究发现，lncRNA GAS5通过增强转录因子E2F1与p27启动子的结合能力，促进p27的转录。我们发现，lncRNA LINC00393在膀胱癌中表达量显著增高，与肿瘤恶性程度相关，并与SIRT1 mRNA表达正性相关（R=0.608，p＜0.001）。此外，干扰LINC00393后，膀胱癌细胞增殖能力明显减弱，同时SIRT1 mRNA和蛋白水平均明显下降。

4.总结。在深入探讨膀胱癌的分子机制过程中，发现LINC00393在膀胱癌组织中的表达显著增加。LINC00393入核后与转录因子PPARg形成复合物，并诱导PPARg从SIRT1基因的启动子区域解离，从而削弱了PPARg对SIRT1基因的转录抑制作用。与此同时，表达增加的SIRT1在入核后，仍然能够结合PPARg的启动子区域，发挥其抑制PPARg表达的作用，从而引起膀胱癌细胞内SIRT1的异常累积。进一步的研究发现，SIRT1的异常累积通过其去乙酰化作用，影响了FOXO信号通路、p53信号通路等多个关键信号通路的正常调节，通过诱导Cyclin D1的表达，抑制E-cadherin的表达，最终促进了膀胱癌细胞的增殖和迁移。本项研究通过详细阐述膀胱癌中LINC00393在PPARg-SIRT1回路中的调控作用及其分子机制，不仅为诠释膀胱癌发生进展的分子机制提供新的科学依据，更为膀胱癌的治疗提供新的潜在靶标。这一发现对于膀胱癌的早期诊断、治疗以及预后评估都具有重要的理论和实践意义。

结语

医学研究生教育，作为我国高层次医学人才培养的重要基础，始终承载着为国家和社会培养杰出医学人才的重大使命。在当前新时代背景下，随着医学科技的飞速发展和新医科理念的提出，如何在新医科的统领下，实现更加符合临床实际需求、更加具有实践性和创新性的实验性教学，已成为当前医学研究生教育面临的新挑战。近年来，随着医学研究的深入和临床问题的复杂化，对实验性课题的需求呈现出爆发性的增长趋势。然而，不容忽视的是，作为医学研究主力军的研究生，在院校内能够获得的基础实验课题指导和条件却相对匮乏，这在一定程度上制约了他们的研究能力和创新能力的提升。因此，本文旨在为解决这一问题，提供一种新的思路和方法。通过深入剖析临床学习负担繁重的医学研究生的实际需求，本文提出了一个操作性强、贴合临床问题、能够深入研究疾病发生发展机制的实验性研究范例。这一范例不仅能有效弥补当前医学研究生在实验课题方面的不足，还能为他们提供一个全新的视角和思考方式，激发他们的创新思维和探索精神。相信这一范例的提出，将为医学研究生的基础性实验课题研究提供有力的支持和指导，进一步推动医学研究生教育的创新和发展。