基于网络药理学探讨解毒祛瘀滋阴方治疗狼疮肾炎的作用机制

摘要：目的 探讨解毒祛瘀滋阴方治疗狼疮肾炎（LN）的潜在机制，为后续研究提供理论依据。方法 利用相关数据库获得解毒祛瘀滋阴方治疗狼疮肾炎（LN）的潜在作用靶点；构建PPI网络图及“药物—成分—靶点—疾病”网络图，确定核心作用靶点；进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，探讨解毒祛瘀滋阴方治疗狼疮肾炎的潜在机制。利用AutoDock软件进行分子对接验证有效成分和靶点的结合活性。结果 解毒祛瘀滋阴方与治疗狼疮肾炎相关的成分有136种，作用靶点有85个。其中槲皮素、木犀草素、山柰酚等为核心成分，AKT1、TNF、IL6等为核心靶点。作用机制可能为参与氧化应激等生物过程。分子对接显示，有效成分和靶点之间结合能较高。结论 解毒祛瘀滋阴方含有多种成分，可作用于多个靶点，并参与多个生物过程和信号通路，治疗狼疮肾炎疗效明显。

关键词：网络药理学；分子对接；解毒祛瘀滋阴方；狼疮肾炎；肾痹

系统性红斑狼疮（SLE）是一种原因不明的系统免疫性疾病，可导致多种组织和器官损伤，其中最严重的器官表现之一便是狼疮肾炎（LN）[1]，这也是导致SLE患者死亡的重要原因[2～3]。LN的治疗通常选用免疫抑制剂，然而接受免疫抑制疗法的患者仍有一定的复发率，同时药物毒性也是不容忽视的问题。中医学将LN归属于“肾脏风毒、肾痹”等范畴[4～5]。研究认为[6]，LN属本虚标实之证，病因病机复杂多样，大致归纳为虚、热、瘀、毒。解毒祛瘀滋阴方主要组成是生地、鳖甲、积雪草、赤芍、青蒿、薏苡仁、升麻、白花蛇舌草、佛手和生甘草，临床发现此方协同糖皮质激素治疗SLE可以起到减毒增效的作用，对于LN也有着良好疗效[7]。本研究基于网络药理学的方法探讨解毒祛瘀滋阴方治疗LN的潜在作用机制。

1材料与方法

1.1 药物有效成分及作用靶点收集

在TCMSP数据库、HERB数据库中，以生物利用度＞30%、类药性＞0.18为限定条件，检索得到解毒祛瘀滋阴方组成药物积雪草、赤芍、青蒿、薏苡仁、升麻、白花蛇舌草、佛手、生甘草的有效成分，以及有效成分的靶点蛋白。利用UniProt数据库将蛋白信息转换为基因信息，用于后续分析。

使用关键词结合自由词的方法在GeneCards数据库、OMIM数据库以及DrugBank数据库中进行检索，获取LN相关靶点基因信息。将解毒祛瘀滋阴方靶点信息和LN靶点信息导入Rstudio中，运行代码对两者取交集，得到两者共同靶点，即解毒祛瘀滋阴方治疗LN的潜在靶点。

1.2 “药物—成分—靶点—疾病”网络图的绘制

构建解毒祛瘀滋阴方组成药物、有效成分、作用靶点、LN四者之间映射关系，将相关文件导入Cytoscape中进行可视化处理，绘制“药物—成分—靶点—疾病”网络图，并利用Analyze Network工具，分析得到网络图的拓扑学信息。

1.3 PPI网络图的构建

在STRING数据库中，上传作用解毒祛瘀滋阴方治疗狼疮肾炎的靶点信息，将物种选择“Homo sapiens”，可信度设置为≥0.4，构建PPI网络图，并导出文件“string_hires_image.png”和“string_interactions.tsv”。

1.4 PPI网络核心靶点的获取

将上述得到的“string_interactions.tsv”文件导入Rstudio中，对PPI网络进行分析，计算PPI网络中的各节点的度值，度值高的节点则为核心节点，其代表的靶点则为核心靶点。

1.5 富集分析

利用Rstudio和clusterProfiler包，对作用靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并绘制气泡图，预测解毒祛瘀滋阴方治疗LN作用的细胞组分、发挥的分子功能，以及参与的生物过程和信号通路。

1.6 有效成分与靶点的分子对接验证

根据有效成分和靶点在“药物—成分—靶点—疾病”网络图与PPI网络图的度值排名，同时参考相关文献的报道，选取部分有效成分和靶点进行分子对接，对其结合活性进行验证。本研究通过TCMSP数据库获得有效成分的立体结构文件，并通过PDB数据库获取靶点蛋白立体结构文件。将相关文件导入AutoDock软件进行分子对接，并将对接结果导入Rstudio绘制结合能热图，利用PYMOL软件展示对接结果立体结构。

2结果

2.1 解毒祛瘀滋阴方治疗狼疮肾炎潜在作用靶点

经过检索及筛选，解毒祛瘀滋阴方组成药物的有效成分为白花蛇舌草7种、鳖甲16种、赤芍29种、丹皮11种、佛手5种、甘草92种、积雪草3种、青蒿22种、生地8种、升麻17种和薏苡仁9种。经过筛选，用于后续研究分析的有效成分为白花蛇舌草5种、鳖甲4种、赤芍13种、丹皮6种、佛手4种、甘草88种、积雪草2种、青蒿19种、生地3种、升麻8种和薏苡仁6种。进行整合去重，最终得到解毒祛瘀滋阴方的有效成分136种，同时得到解毒祛瘀滋阴方有效成分的作用靶点共257个。

在GeneCards数据库中检索得到LN的潜在靶点881个，在OMIM数据库中检索得到3个靶点信息，在DrugBank数据库中检索得到51个靶点信息。经过整合及去重，得到用于后续研究分析的LN潜在靶点917个。对解毒祛瘀滋阴方有效成分的靶点基因和LN潜在靶点基因取交集，得到共同靶点85个，即解毒祛瘀滋阴方治疗狼疮肾炎的潜在作用靶点。

2.2 “药物—成分—疾病—靶点”网络图

利用Cytoscape对解毒祛瘀滋阴方组成药物、有效成分、作用靶点以及LN之间映射关系进行可视化处理，绘制“药物—成分—靶点—疾病”网络图（见图1）。通过Analyze Network工具分析，得出网络图中共有218个节点，1 035条边，网络密度为0.044。其中槲皮素、木犀草素、山柰酚为度值较高的成分，度值分别为72、29、28。因此，槲皮素、木犀草素、山柰酚为解毒祛瘀滋阴方的核心成分，主要存在于青蒿中。

2.3 PPI网络图的构建及核心靶点的预测

将靶点信息导入STRING数据库，导入作用靶点信息，在物种选择栏中选择“Homo sapiens”，将可信度设置为≥0.4，构建PPI网络。在Rstudio中对PPI网络中各节点的度值进行分析，发现度值排名前十的节点为AKT1、TNF、IL6、TP53、CASP3、PTGS2、CXCL8、IL10、STAT3、MMP9，度值分别为70、70、69、67、61、61、60、59、59、56。因此为核心节点，其代表的基因则为核心基因。

2.4 富集分析

在Rstudio中，通过clusterProfiler包及相关代码，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，预测解毒祛瘀滋阴方医治LN可能的作用机制。进行GO分析时，以P＜0.05为限定条件进行筛选，共在2 161个条目中发生富集，其中细胞组分方面富集到35个条目，主要为膜区、囊泡及细胞外基质等。生物过程方面富集到2 033个条目，主要为化学应激反应、氧化应激反应以及对药物的反应等。分子功能方面富集到93个条目，主要与细胞因子结合及受体活性等相关。进行KEGG分析时，按照P＜0.05进行筛选，共对144条信号通路发生富集，主要为Lipid and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis等心血管疾病相关通路。

2.5 有效成分与靶点分子对接验证

选取有效成分槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）、芒柄花素（formononetin）、异鼠李素（isorhamnetin）、柚皮素（naringenin）、甘草素（glyzaglabrin）、青蒿素（artemisinin）、芍药苷（paeoniflorin）与靶点AKT1、TNF、PPARG、CASP3、MAPK1、STAT3、MMP9进行分子对接验证结合活性。其中，结合能＞4.25 kcal/mol 表示分子与靶点之间有一定的结合活性；结合能＞5.0 kcal/mol 表明结合活性较好；结合能＞7.0 kcal/mol 则表示结合活性很强。对各有效成分与靶点的结合能绘制热图（见图2）。其中，青蒿素与MMP9的结合能绝对值最高，显示其结合活性最好，其立体结构见图3。

3讨论

SLE可引起多器官和系统的损伤，LN是其中最严重的器官表现，也是导致SLE患者死亡的重要原因，因此探讨LN的治疗方法具有重要意义。中药复方凭借多成分、多作用靶点、多系统调节的优势，在治疗LN方面有着巨大潜力。本研究基于网络药理学的方法预测了解毒祛瘀滋阴方治疗LN的有效成分及作用靶点，通过GO富集分析与KEGG富集分析探讨了可能的分子机制及信号通路。本研究发现，解毒祛瘀滋阴方含有136种与治疗LN相关的有效成分，可作用于人体中85个靶点。进一步分析发现，解毒祛瘀滋阴方治疗LN的核心作用靶点为AKT1、TNF、IL6等。GO富集分析发现，解毒祛瘀滋阴方主要成分主要参与氧化应激反应。KEGG通路富集分析发现，解毒祛瘀滋阴方所作用的靶点主要与心血管疾病通路相关。可通过调节动脉粥样硬化相关通路，延缓LN进展，提高患者生存率。此外，本研究通过分子对接验证有效成分与靶点的结合活性，发现各有效成分与靶点之间结合活性较好，其中青蒿素与MMP9的结合活性最好。

综上所述，解毒祛瘀滋阴方含有多种成分，可作用于多个靶点，并参与多个生物过程和信号通路，治疗狼疮肾炎疗效明显。

参考文献

[1]沈南，赵毅，段利华，等.系统性红斑狼疮诊疗规范[J].中华内科杂志，2023，62（7）：775-784.

[2]张辉，杨念生，鲁静，等.狼疮肾炎诊疗规范[J].中华内科杂志，2021，60（09）：784-790.

[3]周华，张娅妮，覃嘉宁，等.狼疮肾炎诊治新进展[J].实用药物与临床，2021，24（5）：385-389.

[4]胡宏图，梁伟，丁国华.狼疮肾炎病情活动相关生物标志物的研究进展[J].临床肾脏病杂志，2022，22（5）：433-437.

[5]李伟，齐振强.狼疮肾炎的中医中药治疗[J].中华肾病研究电子杂志，2019，8（1）：10-12.

[6]李丽丽，王翔鹏，向阳.狼疮性肾炎病因病机探析[J].风湿病与关节炎，2017，6（11）：58-60，71.

[7]黄少华.解毒祛瘀滋阴方及方中主要药物对狼疮性肾炎的干预研究[D].杭州：浙江中医药大学，2013.