核桃分心木水提物对肾阳虚大鼠尿17-OHCS、SOD及睾酮的影响

【关键词】 核桃分心木；水提液；超氧化物歧化酶；睾酮

中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1671-0223（2024）01-8-05

核桃分心木为胡桃科植物胡桃（juglans regia L）果实之间的呈蝴蝶形状的木质间隔，又称核桃隔、胡桃衣。分心木呈薄片状，多弯曲，破碎而不整齐。表面淡棕色至棕褐色，或棕黑色，略有光泽。质脆，易折断，以块大、质薄、色黄为佳。性味苦、涩，平。归脾、肾经。功效：涩精缩尿，止血止带，止泻痢。据《全国中草药汇编》记载，其具有“补肾涩精，主治肾虚遗精、滑精、遗尿”之功效。根据中医理论，肾虚遗精、滑精、遗尿均为肾阳虚之表现。故核桃分心木多与肾阳虚征有着密切的联系[1]。

在我国，核桃种植历史悠久，核桃产业发展迅速。据统计，随着不断增多的核桃深加工产品和不断增长的核桃需求，到2021 年核桃在我国市场需求量将达到648.57 万吨[2]。核桃分心木作为核桃产业加工的副产品，主要被用作燃料或丢弃，造成巨大浪费，且污染环境。本研究将核桃分心木水提物用于肾阳虚大鼠模型，观察其一般状态、体温和尿17- 羟皮质类固醇（17-OHCS）含量，血清中超氧化物歧化酶（SOD）及睾酮（T）的含量，探究核桃分心木水提物的作用效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康SD 雄性大鼠40 只， 体质量200±20g，由西安交通大学动物实验中心提供，动物合格证编号：SCXK（ 陕）2021-011。将大鼠适应性饲养（大鼠饲养条件：温度控制在20 ～ 25℃，湿度控制在40% ～ 70%，标准饲料购于西安交通大学动物实验中心）1 周后，根据随机数字表法分为假手术对照组（A 组）、肾阳虚模型对照组（B 组）、核桃分心木水提物治疗组（C 组）及青蛾丸治疗对照组（D 组）。

1.2 试剂、药物及设备

核桃分心木，购自陕西商洛。17- 羟皮质类固醇（17-OHCS）放免检测试剂盒，上海联祖生物科技有限公司；SOD-ELISA 试剂盒，T（睾酮）试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；水合氯醛，青岛宇龙海藻有限公司，批号： H37022673；0.9% 氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司，批号： H51021158；5%葡萄糖氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司，批号： H20043867；甲醇（色谱纯）、三氟乙酸（色谱纯），美国 BCL 公司；蒸馏水。

ZH-DXL 型大鼠代谢笼，安徽正华生物仪器设备有限公司；GC-1200 型自动放免仪，安徽中科中佳科学仪器有限公司；英展TCS-W-300 电子秤，江苏昆山托普泰克电子有限公司；MT-601C 型电子体温计，杭州广发电子技术有限公司；RE-52AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪厂；SCIENTZ-18N 真空冷冻干燥机，山东博科生物产业有限公司；高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；美国Waters1525 高效液相色谱仪；美国Agilent1290Infinity 液相色谱仪；美国Agilent 6540 UHD accurate mass Q-TOF-MS 质谱仪，配有电喷雾电离（ESI）离子源，Agilent MassHunter工作站；Agela Venusil XBP-C18 色谱柱，Agela 科技有限公司；Zorbax Eclipse PlusC18 色谱柱，Agilent 科技有限公司；伯乐T100 梯度PCR 仪，美国伯乐公司。

1.3 实验方法

1.3.1 核桃分心木水提物的准备 取干燥的核桃分心木，粉碎至100 ～ 200 目，称量20.0g 放置于500ml锥形瓶中，加入400ml 蒸馏水，瓶口密封置于阴凉处静置12h，浸提得到核桃分心木水提液。水提液及剩余的粉末均在4℃下冷藏备用。将水提液离心分离（15000r /min），取上清液，上清液经旋转蒸发仪进行浓缩（条件为负压下40℃），将浓缩液经真空冷冻干燥得到分心木水提物干粉。

1.3.2 采用高效液相色谱- 串联飞行时间质谱分析核桃分心木水提液化学成分 将上述提取物置于容量瓶中，加水定容，配置成浓度为5mg/ml 的溶液，采用0.45μm 滤膜过滤。样品溶液在4℃下冷藏备用。利用高效液相色谱- 串联飞行时间质谱分析核桃分心木水提液化学成分，具体方法同李平等[3]。

1.3.3 动物造模及给药 取健康SD 大鼠40 只，经适应性饲养1 周。B、C、D 组大鼠实验前8 小时禁食、禁饮。经10％水合氯醛（0.3ml/100g 体重）腹腔注射麻醉后，俯卧，背部剪毛，备皮后采用0.5% 碘伏进行局部皮肤消毒。在胸椎及腰椎交界处，沿背部正中线纵向向下切开皮约3cm，先使动物右侧卧位，在左侧肋缘与脊柱交界处，纵行剪开薄层腰大肌，切口约2cm，用血管钳交替分离，以显露大鼠左侧肾脏，切口下肾脏呈深红色。肾脏上方的腹后壁脂肪中呈浅黄色的组织即肾上腺，用蛟式血管钳将周围脂肪组织分离开，用眼科剪刀剪下肾上腺的3/4，给予明胶海绵压迫止血，经检查无出血后间断缝合腰大肌筋膜。再使动物向左侧卧，采用同样方法切除右侧肾上腺的3/4。缝合腰大肌筋膜及背部皮肤，碘伏消毒。A 组大鼠除不切除肾上腺外，其它手术过程同B、C、D 组。术后连续5d 在伤口处涂以红霉素药膏，并每只每天注射20 万单位青霉素以预防感染。术后第1 天饲养于用刨花作垫料的塑料鼠盒中，室温保持在21 ～ 25℃，5% 葡萄糖氯化钠注射液代替饮水。术后第2 天独笼饲养于大鼠笼内，常规饲料，5% 葡萄糖氯化钠注射液代替饮水。继续饲养4 周。C 组大鼠：给予核桃分心木水提物（高剂量200mg/kg[4]）制成核桃分心木水提物液1ml，每天清晨9 ∶ 00 灌胃。D组大鼠：给予青蛾丸（80mg/200g·d[5]）制成青蛾丸混悬液1ml，每天清晨灌胃。A 组（假手术组）和B 组（ 模型组） 大鼠给予等容量的生理盐水灌胃。灌胃4 周。

1.4 检测指标

（1）体温：用电子体温计每日清晨8 ∶ 00 依次测量大鼠体温。

（2）尿17- 羟皮质类固醇（尿17-OH-CS）水平：于灌胃4 周后清晨8 ∶ 00 将大鼠依次置于相应标记的代谢笼内至次日清晨8 ∶ 00，收集24h 尿液，滴加防腐剂0.1ml/10ml 防腐，－ 20℃保存，采用放射免疫法检测尿17-OH-CS 含量。

（3）超氧化物歧化酶（SOD）、睾酮（T）含量：于实验最后1 天，麻醉大鼠后，心脏快速采血，离心后严格按照SOD-ELISA 试剂盒及T 试剂盒说明检测大鼠血清中SOD、T 的含量。

1.5 数据处理方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析。计量资料以“±s”的形式表示，多组间均数比较采用多因素方差分析，两两比较采用LSD 检验；计数资料组间率比较采用χ2 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 核桃分心木水提物化学成分

采用高效液相色谱- 串联飞行时间质谱对核桃分心木水提物进行定性分析，结合质谱信息和相关参考文献数据，共计鉴定出4 种化合物的结构，分别为没食子酸、儿茶素、槲皮苷和鞣花酸。

2.2 核桃分心木水提物对肾阳虚大鼠模型的影响

实验大鼠在术后2h 内苏醒，手术伤口基本不影响大鼠爬行及饮食。术后1 周，实验大鼠伤口干燥，伤口皮肤开始愈合；术后2 周，实验大鼠伤口皮肤愈合，开始长出新毛，手术组较假手术组大鼠体毛生长缓慢；术后3 周，除手术组个别大鼠外，体毛能够均匀覆盖手术切口。术后4 周，手术组大鼠出现精神不振、喜蜷卧、反应迟钝、活动减少，体毛稀疏、干枯无光泽，竖毛等表现，提示肾阳虚大鼠模型造模成功。假手术组大鼠一般情况良好，活动较多且反应灵敏，体毛浓密有光泽，大便呈颗粒状。治疗过程中，核桃分心木水提物治疗组及青蛾丸治疗对照组大鼠一般情况均逐渐好转，较模型组反应灵敏，体毛较密、有光泽。

2.3 核桃分心木水提物对大鼠体温和尿17-OHCS 含量的影响

灌胃4 周后，四组大鼠体温及尿17-OHCS 含量比较，差异均有统计学意义（P <0.05）；其中A 组大鼠的体温及尿17-OHCS 含量最高，而B 组最低。

两两比较结果显示，C 组和D 组大鼠的体温及尿17-OHCS 含量明显高于B 组，但低于A 组，差异均有统计学意义（P <0.05）；而C 组低于D 组，差异均有统计学意义（P <0.05），见表1。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能改善大鼠肾阳虚症状，但核桃分心木水提物的作用更加突出。

2.4 核桃分心木水提物对大鼠SOD 活性影响

灌胃4 周后，四组大鼠SOD 活性比较，差异均有统计学意义（P <0.05）；其中A 组大鼠的SOD 活性最高，而B 组最低。两两比较结果显示，C 组和D组大鼠的SOD 活性高于B 组，但低于A 组，差异均有统计学意义（P <0.05）；而C 组低于D 组，差异均有统计学意义（P <0.05），见表2。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能提高大鼠SOD 活性，但核桃分心木水提物的作用优于青蛾丸。

2.5 核桃分心木水提物对大鼠睾酮含量的影响

灌胃4 周后，四组大鼠睾酮含量比较，差异均有统计学意义（P <0.05）；其中A 组大鼠的睾酮含量最高，而B 组最低。两两比较结果显示，C 组和D 组大鼠的睾酮含量高于B 组，但低于A 组，差异均有统计学意义（P <0.05）；而C 组低于D 组，差异均有统计学意义（P <0.05），见表3。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能提高大鼠睾酮含量，但核桃分心木水提物的作用优于青蛾丸。

3 讨论

肾阳虚证为中医名词术语，是由于肾阳虚衰、温煦失职、气化失权所表现的一类虚寒证候，称为肾阳虚证。多由素体阳虚，或年老肾亏，或久病伤肾，以及房劳过度等因素引起。肾阳虚证属于中医理论体系中的重要证候之一，临床表现多样，如神疲乏力、畏寒怕冷、四肢发凉、腰膝酸痛、性功能减退、小便清长、余沥不尽、夜尿频多等。中医提出肾阳虚证发生的命门学说，即肾为先天之本，肾中寓真阴真阳，肾阳主一身之阳气，命门火衰则阳虚之证迭出。阳虚证为诸多病症的根源所在，因此一直备受医学界关注[6]。有研究证明，肾阳虚证与神经内分泌功能关系密切。沈自尹[7] 采用中西医结合的方法治疗肾阳虚证时，发现患者24h 尿17-OHCS 含量普遍低下，经补肾后其值有所提高。并有研究发现肾阳虚与现代医学的神经内分泌免疫系统有关，肾阳虚证在下丘脑- 垂体- 靶腺（肾上腺皮质、甲状腺、性腺、胸腺）轴均有不同环节、不同程度的功能紊乱，且主要发病环节在下丘脑（或更高级中枢）的调节功能紊乱。这也是目前认为造成肾阳虚证的主要病机。中医认为阳气有温煦机体的功能，肾阳为一身阳气之根本。肾阳虚，则温煦功能减弱，机体产热减少，表现为怕冷，喜蜷卧，客观指标上则体温偏低。尿17-OHCS 是反映下丘脑- 垂体- 肾上腺轴功能的客观指标，是沈氏等经过临床实践和深入基层进行一定数量调查后所得出的结论[8]，是肾阳虚证的特异性指标。

SOD 又称超氧化物歧化酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，其具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。对人体不断地补充SOD 具有抗衰老的效果。SOD 在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标。睾酮主要由睾丸分泌，是主要的男性性激素及同化激素，对人体健康有重要的影响，主要包括增强性欲、力量、免疫功能、对抗骨质疏松症等功效。哺乳动物和人在代谢过程中睾丸中可生成一定程度受控的自由基，它与精子的生理功能有关，当自由基的产生超出了抗氧化系统的清除能力时，则会攻击精子，对精子及生物大分子产生各种毒性作用，影响睾丸的生精功能[9]。男性的睾丸受氧化损伤时常伴随有肾阳虚症状[10]。同时睾酮缺乏是男性肾阳虚发生的重要原因[11]。本实验证实，肾阳虚大鼠SOD 活性降低，睾酮含量下降。而在应用核桃分心木水提物灌胃后，SOD 活性增强，睾酮含量升高。提示核桃分心木水提物可以有效对抗氧化损伤，有效改善肾阳虚症状。