血浆miR-146a-5p在2型糖尿病临床诊断中的应用效果

【摘要】  目的  检测血浆中microRNA-146a-5p（miR-146a-5p）在2型糖尿病 （type 2 diabetes mellitus，T2DM） 患者及健康人群血浆中的表达水平，分析miR-146a-5p对T2DM的诊断价值。方法  选取2017年1月至2019年6月医院诊断为T2DM患者47例为病例组（T2DM组）；健康人员28例为对照组。抽取患者静脉血，提取miRNA，应用实时荧光定量PCR法以miR-423-5p为内参照物进行校正，检测两组血浆中miR-146a-5p表达水平；应用ROC曲线分析血浆中的miR-146a-5p对T2DM诊断效能并筛选诊断界值，评价诊断结果的真实性和一致性。结果  与对照组相比，T2DM组患者血浆miR-146a-5p表达水平明显下降（P<0.001）；ROC分析显示，AUC=0.951（95%CI：0.907～0.995），表明血浆miR-146a-5p对T2DM具有较高诊断效能。以血浆miR-146a-5p表达水平（2-∆CT转换后）<0.437为诊断T2DM的标准，诊断结果显示，灵敏度=87.234%，特异度=96.429%，具有较高的真实性，并且Kappa=0.808，诊断结果与实际结果高度一致，具有临床应用价值。结论  T2DM患者血浆miR-146a-5p表达水平显著降低，血浆miR-146a-5p对T2DM的诊断有较高真实性及一致性。

【关键词】  microRNA-146a-5p；2型糖尿病；实时荧光定量PCR；ROC曲线

中图分类号  R587.1;R44    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2023）03--03

大量研究显示，2型糖尿病 （type 2 diabetes mellitus，T2DM ）患者循环系统中常伴有炎性因子表达水平升高[1-3]，提示患者高血糖可能与体内的慢性低度炎症反应有关。miR-146a-5p基因位于人类染色体的第5号，最初认为其具有免疫调节功能的microRNA。国内外曾有学者报道，在糖尿病发生过程中患者胰岛细胞内及血细胞内miR-146a-5p表达水平显著下降[4-5]，但关于T2DM患者血浆中miR-146a-5p表达水平的研究较少。本研究通过检测T2DM患者血浆中miR-146a-5p的表达水平，探讨血浆miR-146a-5p在T2DM诊疗中的应用价值。

1  对象与方法

1.1  研究对象

选取2017年1月至2019年6月医院科室收治新诊断为T2DM的47例患者为病例组（T2DM组），同期选择年龄及性别与T2DM组相匹配的，健康人员28例为对照组。T2DM诊断标准：口服75g葡萄糖耐量试验：如空腹静脉血糖≥7.0mmol/L，糖负荷后2小时静脉血糖 ≥11.1mmol/L即可确诊。患者纳入标准为：①符合1999年WHO诊断标准的T2DM患者；②体质量指数（BMI）在18.5～28.0；③无皮质醇增多症、甲状腺功能异常等影响糖代谢的疾病。排除标准：①1型糖尿病的患者；②C肽水平显著降低的患者；③肝功能异常：ALT≥正常值上限的2.5倍；④肾功能不全：血清肌酐大于正常值；⑤合并冠心病、脑血管疾病等T2DM血管并发症患者，及近期出现糖尿病酮症等急性并发症的患者；⑥近期存在重度感染、有手术、外伤等应激状态者；⑦有严重的其他系统疾病如消化、呼吸、神经、免疫等以及恶性肿瘤病史；⑧妊娠期以及哺乳期的患者；⑨拒绝提供知情同意的受试者。本研究由医院伦理委员会审核后批准，所有研究对象均签署了知情同意书。

1.2  实验室检测方法

（1）标本的采集：早晨8点空腹状态下静脉采血。

（2）血浆中总RNA的提取：本实验使用mirVana Paris Kit的试剂盒，分离血浆后，提取血浆中的RNA，置于-80℃冰箱冻存，具体按照说明书步骤操作。

（3）cDNA的合成：应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR），Taqman探针方法，于冰浴完成，包括：10×buffer 0.8μl、dNTP 0.2μl、抑制剂0.1μl、RNA 4.5μl、RNase-free水 0.4μl、RNA 引物1.5μl、RTase 0.5μl，RT-PCR反应体系为8μl。反应条件设定为：16℃孵育60 分钟、42℃进行孵育60 分钟、85℃孵育5 分钟、4℃持续。

（4）qRT-PCR反应体系的配置，反应体系：2×Taq MAN universal PCR 反应Master 混合物10μl；cDNA 4μl；RNase-free水5μl；TaqMAN probe 1μl，体系的总量为20μl。设置反应条件为：95℃10分钟起始模板进行预变性，95℃15 秒中模板进行变性、60℃ 60 秒退火循环达40次；每个样本均进行副管组，各组重复3次，记录实验的CT值并进行计算取平均值，数据后经过2-∆CT转换之后进行统计学的比较分析。

1.3  数据分析方法

采用SPSS 17.0统计软件分析处理数据，采用GraphPAD Prism 5.0软件制图。计数资料计算百分率，组间率的比较应用卡方检验；正态分布的计量资料用“±s”表示，组间均数比较进行独立样本t检验；非正态分布的计量资料以“M（P25，P75）”表示，组间中位数比较用Kruskal-Wallis秩和检验；应用ROC曲线分析血浆miR-146a-5p对2型糖尿病的诊断效能，并筛选临界值。计算灵敏度和特异度，评价诊断结果的真实性；计算Kappa值评价诊断结果与实际结果的一致性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1  两组研究对象的基本特征比较

两组男女构成、年龄、BMI指数、血胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组间清晨空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血红蛋白，T2DM组显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2  两组血浆中miR-146a-5p表达水平比较

T2DM组血浆miR-146a-5p表达水平（2-∆CT转换后）为0.016（0.006，0.093），对照组为0.848（0.586，1.050），T2DM组的表达水平显著下降，差异有统计学意义（秩和检验χ2=42.192，P=0.000）。

2.3  血浆miR-146a-5p对2型糖尿病的诊断效能

以健康人群为对照组，ROC分析显示其AUC=0.951（95%CI：0.907～0.995），表明血浆miR-146a-5p对T2DM具有较高的诊断效能，根据约登指数最大筛选临界值为0.437。见图1。

2.4  血浆miR-146a-5p用于T2DM的诊断结果

以血浆miR-146a-5p表达水平（2-∆CT转换后）< 0.437为诊断T2DM的标准，诊断结果见表2。结果显示，血浆miR-146a-5p诊断T2DM灵敏度87.234%，特异度96.429%，具有较高的真实性，并且Kappa值为0.808，诊断结果与实际结果高度一致，具有临床应用价值。

3  讨论

miRNA是一类非编码单链小RNA分子，能够调节体内多种蛋白的表达，miRNA广泛存在于机体细胞内及循环系统中。在机体处于相对的稳定状态时，人体组织细胞内以及人体各种循环系统中miRNA的表达量维持稳定，但是，如果人体处于应激或各种疾病的状态下，miRNA分子，会根据各种功能作用从组织细胞中大量的释放到外周血或体液中发挥固定的作用[6]，也有一部分是通过血液系统进行传递，到达受体细胞进一步发挥作用。这种作用机制使得血浆中miRNA的表达量会根据机体不同状态发生变化，并且血浆中miRNA的变化常早于蛋白类的标记物[7]，以上特点使血浆miRNA具有成为全新疾病检测标记物的潜能。

miR-146a-5p在T2DM中的研究显示，T2DM患者外周血单个核细胞中表达水平显著低于正常对照组[4]。在T2DM大血管并发症患者血浆中miR-146a-5p表达水平显著降低[8]。成人糖尿病患者，当合并缺血性脑血管疾病发现其血浆miR-146a-5p分子水平较单纯糖尿病患者降低，机制可能是发生了级联诱导的血小板激活，中国糖尿病患者中有的学者将血浆miR-146a-5p表达水平降低，定义为缺血性脑血管病的预测之一[9]。而目前国内外关于T2DM患者血浆中miR-146a-5p表达水平以及血浆miR-146a-5p对T2DM诊断价值的研究尚未见报道，本研究通过检测T2DM组与对照组血浆miR-146a-5p并进行比较，提示T2DM组患者血浆中miR-146a-5p水平是显著下降的，进一步通过ROC曲线分析血浆miR-146a-5p对于T2DM诊断价值，ROC分析显示其AUC=0.951（95%CI：0.907～0.995），表明血浆miR-146a-5p对T2DM具有较高的诊断效能，通过约登指数计算出其临界值为0.437，敏感度为0.946，特异度为0.872。进一步以血浆miR-146a-5p水平<0.437为诊断T2DM的标准显示，血浆miR-146a-5p诊断T2DM灵敏度87.234%，特异度96.429%，具有较高的真实性，并且Kappa值为0.808，诊断结果与实际结果高度一致，具有临床应用价值。以上结果说明，血浆miR-146a-5p可能是T2DM诊断的潜在标记物。

本实验通过检测T2DM患者血浆miR-146a-5p表达水平，证实血浆miR-146a-5p在T2DM发展过程中表达水平会发生显著变化，并对T2DM具有较高诊断价值。

4  参考文献

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[2022-12-13收稿]