响应面法优化稠李果色素提取工艺

摘 要：本文以稠李果为原料，采用超声辅助醇提取法来提取稠李果中色素。通过单因素试验，研究提取温度、乙醇体积分数、超声时间、提取溶液pH值以及料液比对色素提取率的影响。采用响应面法对色素提取条件进行优化，并结合实际情况调整，结果显示提取工艺条件调整为提取温度50 ℃、乙醇体积分数60%、料液比1∶10（g∶mL），提取时间30 min。在此条件下，稠李果提取液中色素吸光度为0.615，折合稠李果色素含量为5.54 mg·g-1。

关键词：稠李果；响应面法；色素；提取；超声辅助醇提取法

Abstract： In this paper， Prunus padus fruit was used as the raw material， and the pigment in Prunus padus fruit was extracted by ultrasonic-assisted alcohol extraction method. Through single-factor experiments， the effects of extraction temperature， ethanol volume fraction， ultrasonic time， pH value of the extraction solution， and solid-liquid ratio on the pigment extraction rate were studied. The response surface methodology was adopted to optimize the pigment extraction conditions， and adjustments were made considering the actual situation. As a result， the extraction process conditions were adjusted to an extraction temperature of 50 ℃， an ethanol volume fraction of 60%， a solid-liquid ratio of 1∶10 （g∶mL）， and an extraction time of 30 minutes. Under these conditions， the absorbance of the pigment in the Prunus padus fruit extract was 0.615， and the equivalent Prunus padus fruit pigment content was 5.54 mg·g-1.

色素是广泛存在于植物、动物和微生物细胞中的化学物质，也是生命科学领域的一个重要研究对象。色素由天然色素和人工合成色素共同组成。多数人工合成色素经过人体代谢后会产生有毒物质，对人体有很大的毒副作用。因此，合成色素在我国允许使用的程度被大大限制[1]。与人工合成色素相比，绝大多数的天然色素无毒副作用，且具有特定的营养价值和医疗保健功效[1-3]。中国目前可以利用的天然色素有限，还有大量的天然色素尚未被广泛研究，所以对色素提炼与纯化技术进行深入研究具有重要意义[2]。

稠李（Prunus padus L.），蔷薇目蔷薇科稠李属植物[4]。稠李果近球状，直径为1.0～1.2 cm，成熟时为紫黑色。稠李果内含有大量的天然红色素，具有较好的稳定性、抗氧化性、抗疲劳等功效，其目前主要用于观赏，没有很好地发挥其在食品中的应用价值[3]。本试验旨在探究稠李果中色素的提取，在保证提取纯度的前提下，优化其工艺条件，提高提取率。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 实验材料与试剂

稠李果，吉林农业科技学院药植园，经过吉林农业科技学院中药学院教师鉴定；无水乙醇、浓盐酸、氢氧化钠，均为分析纯，沈阳市新化试剂厂；香草醛（分析纯），天津市光复精细化工研究所；儿茶素标准品（≥98%），成都芬瑞斯生物技术有限公司；标准pH缓冲剂（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

XS-10多功能粉碎机，上海兆申科技有限公司；DHG-9420 A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；星火牌C型玻璃仪器气流烘干器，郑州长城科工贸有限公司；KQ-700V数控超声波清洗机，济宁天华超声电子仪有限公司；TGL-20000CR高速离心机，上海安亭科学研究厂；AUY120分析天平，岛津企业管理（中国）有限公司；UV-2450紫外分光光度计，岛津企业管理（中国）有限公司；METTLERTOLEDO酸度计，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 稠李果预处理

采摘新鲜稠李果，清洗干净，经鉴定样品可用于色素提取试验。将清洗好的稠李果放入电热鼓风恒温干燥箱中，恒温50 ℃烘干24 h，去核后打磨成粉，过80目筛密封保存备用。

1.2.2 提取工艺

称取稠李果粉→加入100 mL圆底烧瓶→加入乙醇水溶液→超声提取→制冷高速离心→稀释→测量吸光度。

1.2.3 最大吸收波长测定

准确称取0.50 g稠李果粉末样品，置于圆底烧瓶中，加入pH值为1.5、体积分数为50%的乙醇水溶液25 mL，在40 ℃下超声提取30 min。取上清液离心后取上清液稀释，用紫外分光光度计在波长为350～750 nm下扫描，得到紫外可见吸收光谱图。稠李果提取液在530 nm处有最大响应值。因此，本试验在530 nm的波长下测定提取液，以分析不同提取条件对稠李果色素吸光度的影响。

1.2.4 标准曲线绘制

使用儿茶素标准品配制浓度为0.01、0.04、0.08、0.12 mg·mL-1和0.16 mg·mL-1的标准溶液。各取1 mL分别加入棕色试剂瓶中，加入2 mL质量分数为1%香草醛甲醇溶液，混合振荡摇匀后，再加入2 mL浓盐酸。避光放入30 ℃水浴中，5 min后使用紫外可见分光光度计测量530 nm波长处的吸光度，制作儿茶素标准品标准曲线y=0.027 76+9.478 59x；R2=0.999 7。

1.2.5 单因素试验

称取稠李果粉末0.50 g样品24份（分成5组），分别置于150 mL圆底烧瓶中，调整超声频率为800 W。在基础实验条件下[温度为50 ℃，乙醇体积分数为60%，提取时间为30 min，料液比为1∶10（g∶mL），pH值为1]，分别在不同温度（30、40、50、60 ℃和70 ℃），不同乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%和90%）、不同提取时间（10、20、30、40 min和50 min）、不同料液比（1∶5、1∶10、1∶30、1∶70和1∶90，g∶mL）和不同pH值（1、3、5和7）下对稠李果中色素进行提取[5]。提取结束后，取上清液在10 000 r·min-1下，制冷高速离心10 min，取上清液5 mL，稀释10倍，分别测量在530 nm波长下的吸光度[6]。

1.2.6 响应面分析法优化试验条件

根据单因素试验结果和Box-Behnken设计原理，以提取时间、料液比、提取温度和提取剂浓度为自变量，吸光度为因变量，设计4因素3水平的响应面法分析试验，预测稠李果色素提取条件的最佳工艺。响应面因素水平见表1。

1.2.7 稠李果色素定量分析

准确称取2.000 0 g稠李果粉末置于100 mL圆底烧瓶中，加入pH值为1的50%乙醇水溶液18 mL，超声提取30 min，取上清液在10 000 r·min-1下，制冷高速离心10 min得提取液原液。取上清液5 mL稀释10倍，使用紫外分光光度计测量530 nm波长下的吸光度A[7]。色素含量计算公式为

式中：P为稠李果色素提取液原液中色素含量，mg·mL-1；A为稠李果色素提取液稀释液吸光度值；N为提取液原液稀释倍数；W为稠李果色素粉末中色素含量，mg·g-1；V为提取液原液体积，mL；M为稠李果粉末质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取温度对稠李果色素提取的影响

由图1可知，吸光度随着提取温度的升高呈现先增后降的趋势。当提取温度为50 ℃时吸光度最高。由于色素分子运动在低温时缓慢，提取率不高；而当温度过高时，稠李果色素结构稳定性受到破坏，同时过高的温度也会使乙醇挥发，导致吸光度下降[5]。

2.1.2 乙醇体积分数对稠李果色素提取的影响

由图2可知，在乙醇体积分数低于60%时，随着乙醇体积分数的增加，溶液的吸光度也会增加。当乙醇体积分数为60%时，溶液的吸光度达到最大值，之后呈现下降趋势，最终趋于平稳，所以最佳提取剂浓度为60%。稠李果色素提取液的吸光度受乙醇体积分数影响。乙醇体积分数较低时，乙醇的溶解力较小，吸光度下降；而当乙醇体积分数较高时，脂溶性物质的溶解度增大，使色素提取液的沸点降低，难以保持液体的稳定性，影响提取量和吸光度的结果[8]。

2.1.3 提取时间对稠李果色素提取的影响

由图3可知，吸光度随着提取时间的延长呈现先增加后降低的趋势，当提取时间为30 min，吸光度最高。超声波空气化效应和机械粉碎作用，可以增强物质分子的运动频率和速度。在稠李果色素提取过程中，超声波能提高溶剂的穿透力，从而促进色素的快速释放。但是超声时间过长会导致色素降解和提取量的降低，最终吸光度也会下降[9]。

2.1.4 料液比对稠李果色素提取的影响

由图4可知，当料液比为1∶10时，吸光度最大。料液比对色素提取有很大影响，如果提取物占比太高，部分提取物不能被提取剂浸润使得提取效果下降；如果提取物质占比太低，提取剂会吸收超声波的热量和能量，从而降低提取率，导致吸光度改变[10]。

2.1.5 提取液pH值对稠李果色素提取的影响

由图5可知，不同的酸碱对色素的稳定性有较大影响，酸度越高色素越稳定或者碱度越高色素越稳定，又或者在固定的酸碱下色素最稳定[11-12]。提取液的酸碱度不同，导致色素提取量有所变化，进而影响吸光度[13]。本实验中pH值越低，色素越稳定，在pH值为1时，色素已经达到理想的稳定程度，为了便于pH值调试，本研究将pH值的最佳水平设定为1。

2.2 响应面法设计与结果分析

2.2.1 回归方程的建立与分析

由表2可知，利用Design Expert 8.0.6软件，采用Box-Behnken模型建立二次响应面法回归方程，以提取温度（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）和料液比（D）为响应因素，以吸光度（Y1）为响应值，得到回归模型Y1=0.615 0+0.010 8A+0.016 0B+0.004 9C+0.011 4D-0.008 2AB-0.000 15AC-0.007 3AD-0.020 8BC-0.010 5BD+0.008 5CD-0.046 6A2-0.049 9B2-0.053 5C2-0.030 3D2。

由表3可知，模型的F值为58.32，因噪声而影响改变的概率P小于0.000 1。P＜0.05，说明该模型显著。失拟项F值为0.081，说明失拟情况相对于纯误差不显著，噪声能改变失拟项F值的概率为99.93%，也可以看出模型是合理的。模型的预测极差平方值R2=0.983 1，调整极差平方值R2adj=0.966 3，二者差小于0.2，属于合理范围。信噪比27.040，大于4，表明模型非常显著。