克氏原螯虾壳中虾青素提取工艺优化

摘 要：虾青素是一种类胡萝卜素，有强大的天然抗氧化能力，主要存在于虾、蟹、鲑鱼、藻类等水产生物中。本文采用离子液体微乳液从克氏原螯虾壳中提取虾青素，比较了不同离子液体的提取情况，选取辛基三丁基溴化磷进行后续实验。分别研究了固液比、离子液体微乳液成分比例、超声功率和超声时间对虾青素提取率的影响，并在单因素基础之上进行正交实验，结果显示最优工艺条件为固液比1∶30，离子液体微乳液成分比0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超声功率150 W，超声时间25 min，此时虾青素提取率为581.52 μg·g-1。

关键词：虾青素；离子液体；克氏原螯虾

Abstract： Astaxanthin is a carotenoid with powerful natural antioxidant capacity， which is mainly found in aquatic organisms such as shrimp， crab， salmon and algae. In this paper， astaxanthin was extracted from Procambarus clarkii shells， by using ionic liquid microemulsion， and the extraction of different ionic liquids was compared， and octyltributylphosphonium bromide was selected for the subsequent experiments. The effects of solid-liquid ratio， ionic liquid microemulsion composition ratio， ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction rate of astaxanthin were investigated separately， and orthogonal experiments were carried out on the basis of a single factor， and the results showed that the optimal process conditions were solid-liquid ratio of 1∶30， ionic liquid microemulsion composition ratio of 0.20∶0.12∶0.48∶0.20， ultrasonic power of 150 W， ultrasonic time of 25 min， the astaxanthin extraction rate was 581.52 μg·g-1 under this condition.

克氏原螯虾俗称小龙虾，富含虾青素、甲壳素、蛋白质、脂类、氨基酸等营养物质。据最新《中国小龙虾产业发展报告（2024）》，我国小龙虾年产量达到316.10万t。伴随其庞大的销量，每年产生大量的虾壳、虾头等加工副产物，约占小龙虾质量的33%，不但造成生物资源浪费严重，而且会对环境造成污染。虾青素是一种酮类脂溶性胡萝卜素，其生物活性远远优于其他抗氧化剂。虾青素相关产品市值不断攀升，2025年预计达10亿元，目前95%的虾青素产品是人工合成来源。虾青素合成路线较复杂，抗氧化活性低，且合成过程对环境有较大影响[1-2]。同时，消费者日益增长的食品安全意识以及越来越严格的政府监管，使得天然来源的虾青素成为广泛关注的焦点。从小龙虾中提取虾青素可有效应对天然虾青素市场的需求。

虾青素的提取方法目前主要包括碱液法、油溶法、有机溶剂提取法、超临界流体萃取法。但碱液法pH值大，油溶法温度高，都易引起虾青素降解，提取率很低[3]。超临界CO2流体萃取设备昂贵、技术要求高，用于工业化生产尚存在很大困难[2]。较多团队研究使用传统有机溶剂提取[4]，但有机溶剂通常具有挥发性和毒性，因此目前较多研究人员在探索更加安全高效的提取技术。

离子液体（Ionic Liquids，ILs）由阴、阳离子组成，与传统有机溶剂相比，具有低蒸气压、不可燃性、高热稳定性和可再生性，在食品工业中，可作为有机溶剂的潜在代替物。但离子液体分子黏度大，不利于传质，在生物分子萃取领域受到限制，更多适合以助剂形式来使用[5]。微乳液是由两种互不相溶的液体在表面活性剂的作用下形成的热力学稳定体系，具有高稳定性、低黏度，以及对亲水和亲脂化学物的增溶能力。将离子液体引入微乳液，能兼顾各自优点，扩展离子液体和微乳液的应用范围。

本项目在前期研究的基础上，用基于磷的离子液体微乳液从克氏原螯虾虾壳中提取虾青素，充分利用水产品副产物资源制备虾青素，补充天然虾青素产品市场的不足。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

克氏原螯虾，购自浙江台州椒江大润发超市；虾青素标准品，1，2-丁二醇、酒石酸、氯化胆碱、正丁醇、卵磷脂均为分析纯，购自上海市阿拉丁生化科技有限公司；辛基三丁基溴化磷、四丁基磷三氟乙酸盐、辛基三丁基磷四氟硼酸盐、辛基三丁基磷三氟乙酸盐均为分析纯，购自青岛奥立新科材料科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

UV Cary100紫外分光光度计，美国瓦里安公司；KQ-250DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DGG-9140B电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；GM300刀式研磨仪，德国RETSCH（莱驰）公司；BSA2202S电子分析天平，德国赛多利斯天平有限公司；Sorvall ST 16通用台式高速离心机，美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

制备得到0.002、0.004、0.006、0.008 mg·mL-1 和0.010 mg·mL-1的标准溶液，在最大吸收波长（472 nm）下，分别测量各个溶液的吸光度，绘制标准曲线。1.2.2 克氏原螯虾中虾青素的提取

（1）克氏原螯虾处理。去肉后，虾壳清洗干净，置于恒温鼓风干燥箱中55 ℃干燥5 h，研磨过100目筛得虾壳粉，于-18 ℃冷冻储存备用。

（2）离子液体微乳液制备。离子液体∶卵磷脂∶正丁醇∶H2O按一定质量混合，超声5 min以使离子液体混合均匀。

（3）提取克氏原螯虾中虾青素。称取虾壳粉2 g于离心管中，按一定固液比加入离子液体微乳液，超声波辅助提取结束后室温下12 000 r·min-1离心20 min，上层液体倾倒出，采用紫外可见分光光度法测虾青素含量，并计算虾青素提取率。

1.2.3 虾青素提取率的计算方法

虾青素提取率的计算公式如下。

式中：W为虾青素提取率，μg·g-1；x为虾青素的质量浓度，μg·mL-1；V为虾青素粗提液体积，mL；N为稀释倍数；M为虾壳干重，g。

1.3 离子液体微乳液提取虾青素的工艺优化

1.3.1 单因素实验

（1）不同离子液体构成的微乳液对虾青素提取率的影响。固定离子液体∶卵磷脂∶正丁醇∶水质量比=0.20∶0.12∶0.48∶0.20，离子液体微乳液与虾壳粉的固液比为1∶20（g∶mL），超声功率100 W，超声时间30 min。离子液体分别为四丁基磷三氟乙酸盐、辛基三丁基磷四氟硼酸盐、辛基三丁基溴化磷、辛基三丁基磷三氟乙酸盐，提取后检测虾青素提取率。

（2）固液比对虾青素提取率的影响。固定离子液体为辛基三丁基溴化磷，离子液体∶卵磷脂∶正丁醇∶水质量比=0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超声功率100 W，超声时间30 min。微乳液与虾壳粉的固液比分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80和1∶90（g∶mL），提取后检测虾青素提取率。

（3）离子液体微乳液成分比例对虾青素提取率的影响。固定离子液体为辛基三丁基溴化磷，固液比为1∶30（g∶mL），超声功率100 W，超声时间30 min。离子液体∶卵磷脂∶正丁醇∶水质量比分别为0.10∶0.12∶0.48∶0.30、0.15∶0.12∶0.48∶0.25、0.20∶0.12∶0.48∶0.20、0.25∶0.12∶0.48∶0.15、0.30∶0.12∶0.48∶0.10、0.35∶0.12∶0.48∶0.05，提取后检测虾青素提取率。

（4）超声功率对虾青素提取率的影响。固定离子液体为辛基三丁基溴化磷，固液比为1∶30（g∶mL），离子液体∶卵磷脂∶正丁醇∶水质量比为0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超声时间30 min。超声功率分别为50、100、150、200、250 W，提取后检测虾青素提取率。

（5）超声时间对虾青素提取率的影响。固定离子液体为辛基三丁基溴化磷，固液比为1∶30（g∶mL），离子液体∶卵磷脂∶正丁醇∶水质量比为0.20∶0.12∶0.48∶0.20，超声功率为150 W。超声时间分别为5、10、15、20、25、30 min和40 min，提取后检测虾青素提取率。

1.3.2 正交优化实验

在单因素实验基础上，选取固液比、离子液体微乳液成分比例、超声功率、超声时间作为正交实验的因素，每个因素选取3个水平进行正交实验，优化工艺条件。因素水平表见表1。

2 结果与分析

2.1 不同离子液体微乳液对虾青素提取率的影响

本实验选择纯水，同时添加天然表面活性剂卵磷脂和助表面活性剂正丁醇降低了离子液体、水和虾青素之间的界面张力，大大提高虾青素在整个离子液体中的溶解度。为了确定最佳的ILs微乳液，对不同阳离子和阴离子构成的ILs微乳液提取情况进行了比较。实验发现，虾青素提取率从大到小依次是辛基三丁基溴化磷（[P4448]Br）＞三氟乙酸三丁基辛基膦（[P4448]CF3COO）＞四丁基三氟乙酸膦（[P4444]CF3COO）＞辛基三丁基磷四氟硼酸盐（[P4448]BF4），具体见图1。除了[P4448]BF4/（卵磷脂+正丁醇）/水微乳液，其他离子液体微乳液均有较强的虾青素提取能力，这主要是因为他们有更高的虾青素溶解度，这样也与实验中观察到的黏度一致，其中[P4448]Br/（卵磷脂+正丁醇）/水微乳液黏度最小，有最高的虾青素提取率。

2.2 固液比对虾青素提取率的影响

溶剂与目标分子之间的静电和亲水/疏水相互作用是影响溶剂能力的主要因素，增加离子液体微乳液用量可以加强这种相互作用。从图2可以观察到当固液比从1∶5到1∶30时，虾青素的提取率从350.14 μg·g-1增加到541.64 μg·g-1，说明在一定范围内增加离子液体微乳液用量，虾青素的溶解度显著增加。继续改变固液比，虾青素提取率变化不大，甚至有降低的趋势。

2.3 离子液体微乳液成分比例对虾青素提取率的影响

离子液体微乳液成分比不同，对虾青素的溶解度不同。从图3中能够看出，离子液体[P4448]Br占比从10%增加到20%时，虾青素的提取率从513.28 μg·g-1增加到541.64 μg·g-1，说明[P4448]Br的适当增加能够加强与虾青素之间的氢键、偶极-偶极、π-π和范德华相互作用。但是当继续增加[P4448]Br在离子液体微乳液中的占比，虾青素提取率下降，这可能主要是因为[P4448]Br的用量过多，导致整个提取溶液的黏度变大，影响了传质效率。