高效液相色谱-串联质谱法测定水果中酚酸

Determination of Phenolic Acids in Fruits by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

RUANJiacheng，WANG Hao，YUANXuyan （Bureau Veritas Science and Technology Service （Xi'an） Co.，Ltd.， Xi'an 71oooo， China）

Abstract： Establish a detection method for phenolic acids in fruit using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry The nine phenolic acids showed good linearity in the range of 0.5ngmL^-1 to 500.0ng⋅mL^-1 （R²>0.998） ，with detection limits as low as 0.10ng⋅mL^-1 to 0.25ng⋅mL^-1 and quantification limits between 0.33ng⋅mL^-1 to 0.83ng⋅mL^-1 . The recovery rate was 82.9% to 116.2% ，and the relative standard deviation was between 2.4% to 6.1% .Actual sample testing shows that there are differences in the composition and content of phenolic acidsamong the three fruits.Blueberries have the highest totalphenolic acid content，followed by strawberies，and grapefruit has the lowest.This method has high sensitivityand good accuracy，and the research results provide reference for fruit quality evaluation， nutritional analysis， and functional food development.

Keywords： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; fruits; phenolic acid

酚酸是水果中常见的次生代谢产物，影响水果色泽、风味和品质，具有抗氧化等生物活性，对人体健康有益。随着人们生活水平的提高，消费者对水果营养价值愈发关注，精准测定水果中酚酸的种类和含量，成为食品科学与营养学研究热点。分光光度法和薄层色谱法虽操作简便，但灵敏度欠佳，难以分析复杂基质中的痕量酚酸，同时对多种酚酸的定性、定量分析有局限性。高效液相色谱虽分离能力强，但面对结构相似的酚酸，定性准确性受限[1]。高效液相色谱－串联质谱法结合了高效液相色谱法的高分离性能与串联质谱法的高灵敏度、高选择性，可实现酚酸的精准分析。

1材料与方法

1.1材料与试剂

蓝莓、草莓、葡萄柚，购自本地大型果蔬市场;9种酚酸标准品（纯度 ⩾98% ），Sigma-Aldrich公司。甲醇、乙腈，色谱纯，FisherScientific公司；甲酸、盐酸，分析纯，上海安谱科技公司；实验用水由Milli-Q超纯水系统制备。

1.2 仪器与设备

WatersAcquityUPLC超高效液相色谱仪，Agilent公司；XevoTQ-S三重四极杆质谱仪，Sciex公司；漩涡振荡器，杭州米欧仪器有限公司；高速离心机，日立公司；超声清洗器，宁波新芝生物科技有限公司；氮吹仪，北京优晟；固相萃取装置，上海靳澜仪器制造有限公司；高精度电子天平，Mettler公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

挑选果实饱满、无病虫害和机械损伤的蓝莓、草莓、葡萄柚，用超纯水冲洗晾干，备用。称取2.00g 水果样品，加入含抗坏血酸和乙二胺四乙酸的80% 甲醇溶液，涡旋振荡、超声提取后离心，取上清液。残渣用 4mol⋅L^-1NaOH 溶液水解，盐酸调节pH 值，乙酸乙酯萃取，氮吹浓缩。用初始流动相溶解残渣，过有机滤膜后待上机测定[2]。

1.3.2 固相萃取净化

选用OasisHLB固相萃取柱，依次用甲醇、超纯水活化，使样品溶液以 1～2mImin^-1 的流速通过[3]。用 5% 甲醇水溶液淋洗除杂，甲醇洗脱目标酚酸，氮吹浓缩后用初始流动相溶解，过滤后供高效液相色谱－串联质谱仪分析。

1.3.3 色谱与质谱条件

色谱柱选用WatersAcquityUPLCBEHCl8柱，柱温 35^∘C 。流动相A为 0.1% 甲酸水溶液，B为乙腈，采用梯度洗脱，流速 0.3mL⋅min^-1 ，进样体积 2μL 。质谱采用电喷雾离子源，负离子扫描和多反应监测模式，通过优化标准品溶液确定各酚酸的检测参数[4-5]。

1.3.4 方法学验证

配制浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0ngmL^-1 和 500.0ngmL^-1 的酚酸混合标准溶液。按照1.3.3的色谱和质谱条件进行测定，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。在已知酚酸含量的水果样品中添加低浓度（ sng^.g^-1. ）、中浓度（ 50ng⋅g^-1 ）、高浓度（ 200ng⋅g^-1 ）的酚酸标准溶液，平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差（RelativeStandardDeviation，RSD），评估准确度和精密度。

2 结果与分析

2.1标准曲线的建立

以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表1。9种酚酸在 0.5～ 500.0ng⋅mL^-1 时， R² 均大于0.998，说明线性关系良好。以3倍信噪比（ S/N=3 ）计算方法检出限，以10倍信噪比（ S/N=10 ）计算定量限，检出限为 0.10～ 0.25ng⋅mL^-1 ，定量限为 0.33～0.83ng⋅mL^-1 车

2.2 回收率和精密度

由表2可知，在低、中、高3个加标水平下，9种酚酸的回收率在 82.9%～ 116.2% ，RSD在2.4%～6.1% 。表明该方法具有良好的准确度和精密度，能满足水果中酚酸含量测定要求。

2.3 实际样品测定

采用优化后的方法对蓝莓、草莓、葡萄柚中的酚酸含量进行测定，每个水果品种重复测定3次，结果取平均值，具体数据见表3。蓝莓中总酚酸含量最高，草莓次之，葡萄柚最低。不同水果中酚酸的组成和含量存在差异，可能与水果品种、生长环境、采摘时间等因素有关。

3结论

本文建立了高效液相色谱－串联质谱法测定水果中9种酚酸含量的分析方法。通过对样品前处理、色谱和质谱条件的优化，该方法在 0.5～500.0ng⋅mL^-1 时，相关系数 R² 均大于0.998，说明线性关系良好，检出限为 0.10～0.25ng⋅mL^-1 ，定量限为 0.33～ 0.83ng⋅mL^-1 ，回收率在 82.9%～ 116.2% ，RSD在2.4%～6.1% ，具有良好的线性范围、灵敏度、准确度和精密度。实际样品测定结果表明，蓝莓、草莓、葡萄柚3种水果中酚酸的组成和含量存在明显差异蓝莓中总酚酸含量最高，主要得益于其丰富的儿茶素和阿魏酸含量；草莓和葡萄柚的总酚酸含量相对较低。这些差异为水果品质评价、营养分析以及功能性食品开发提供了重要的参考依据。

参考文献

[1]严俊安，谭洪兴，唐增煦，等.高效液相色谱－串联质谱法同时测定水果中13种酚酸[J].卫生研究，2024，53（5）：790-796.

[2]周春红，田毅，刘畅，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水果及其制品中9种禁用色素[J].现代食品，2024（19）：173-178.

[3]钟永生，万承波，朱钦，等.超高效液相色谱－串联质谱法同时测定食用农产品（水果）中14种甜味剂含量[J].食品科技，2024，49（4）：315-321.

[4]刘超烽，林志藩，周玉玲.超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法快速测定热带水果饮料中的胭脂虫红[J]食品安全质量检测学报，2023，14（15）：113-118.

[5]张敏，黄京平，赵文，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中24种酚酸和黄酮类化合物[J]分析测试学报，2022，41（11）：1636-1643.