HPLC-柱后光化学衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1的不确定度评定

摘 要：本文采用HPLC-柱后光化学衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量，通过系统分析整个测定过程的影响因素，评估不确定度来源，评定各个不确定度分量，发现标准物质浓度、标准溶液配制与测量重复性引入的不确定度对测量结果的影响较大。当玉米样品中黄曲霉毒素B1含量为7.86 μg·kg-1时，扩展不确定度为0.68 μg·kg-1（k=2）。

关键词：高效液相色谱-柱后光化学衍生法；玉米；黄曲霉毒素B1；不确定度

Abstract： High performance liquid chromatography-post column photochemical derivatization method was used to determine aflatoxin B1 content in corn. Through systematic analysis of the influencing factors of the whole determination process， the sources of uncertainty were evaluated， and each uncertainty component was evaluated. It was found that the uncertainty introduced by the concentration of standard substance， the preparation of standard solution and the measurement repeatability had a great influence on the measurement results. When aflatoxin B1 content was 7.86 μg·kg-1， the extended uncertainty was 0.68 μg·kg-1（k=2）.

Keywords： high performance liquid chromatography-post column photochemical derivatization method; maize; aflatoxin B1; uncertainty

黄曲霉毒素B1是一种对人类健康危害极大的霉菌毒素，存在于土壤、动植物中，尤其容易污染玉米、小麦、花生等粮食作物与坚果，其通过食物链摄入人体后，不仅会损害人体免疫系统，还有强烈的致畸、致癌、致突变效应[1-2]。近年来，在日常食品安全抽检工作中发现，食用油、炒货坚果、芝麻酱等粮食和坚果产品中黄曲霉毒素B1问题比较突出。因此，准确测定玉米等农产品中的黄曲霉毒素B1含量非常重要。测量不确定度评定可以反映检验检测过程中影响测定结果准确性的各个因素，进而提升检测结果的准确度。本研究参照《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）[3]中第三法高效液相色谱-柱后衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量，依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）中[4]规定的方法程序评定该检测过程中的测量不确定度，以期提高测量结果的准确性和可信度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

U3000高效液相色谱仪（配荧光检测器），美国赛默飞公司；ME3002E电子天平（精度0.01 g），美国梅特勒-托利多公司；KH-100DB超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；TG16G高速离心机，常州市亿能实验仪器厂；Synergy超纯水机，德国Milli-Q公司。

甲醇中黄曲霉毒素B1（浓度为2 μg·mL-1），坛墨质检科技股份有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠均为分析纯，无锡市亚泰联合化工有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

（1）标准使用溶液。准确吸取0.5 mL浓度为2 μg·mL-1的黄曲霉毒素B1标准溶液，并用甲醇定容至10 mL，混匀，配制成浓度为100 ng·mL-1的标准使用液。

（2）标准系列溶液。分别吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和3.0 mL的标准中间液，用流动相定容至10 mL，混匀，配制为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1和30 ng·mL-1的标准系列溶液。

1.2.2 样品处理过程

称取5 g粉碎、过筛、混匀的玉米试样于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇-水溶液（70+30），超声振荡20 min，于6 000 r·min-1下离心10 min，得到上清液。

准确移取4 mL上清液，加入23 mL PBS溶液，混匀。取出免疫亲和柱，待其恢复至室温后，连接在注射器套管上，将上述样液移入注射器中。再将空气压力泵连接在注射器上，通过调节压力使溶液以1滴/s的速度过柱，待溶液滴完空气进入时，加入20 mL超纯水，以1滴/s淋洗免疫亲和柱，弃去流出液，直至抽干小柱。向小柱中准确加入2 mL甲醇以1滴/s的流速进行洗脱，收集全部洗脱液于玻璃刻度试管中，于50 ℃下氮气吹干。用流动相溶解残渣，并定容至1 mL，过滤膜后上机测定。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；流动相：甲醇+乙腈（50+50）∶水（32∶68），等度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；荧光检测器：激发与发射波长分别为360 nm、440 nm；进样量：50 μL。

2 结果与分析

2.1 不确定度分析

2.1.1 测量数学模型

玉米试样中黄曲霉毒素B1含量的计算公式为

式中：X为玉米试样中黄曲霉毒素B1含量，μg·kg-1；c为待测试液中黄曲霉毒素B1浓度，ng·mL-1；V1为提取液体积，mL；V2为过柱时分取样液体积，mL；V3为最终待测液定容体积，mL；m为称样量，g；1 000为单位换算系数。

2.1.2 不确定度来源

根据样品处理过程与测量数学模型，该方法的测量不确定度来源为称样量、标准物质浓度、标准溶液配制、样液移取定容体积、标准曲线拟合及测量重复性引入的不确定度。

2.2 测量不确定度评定

2.2.1 称样量引入的相对标准不确定度

使用ME3002E电子天平称取5.00 g试样，由检定证书查得示值误差为0.02 g，假设按照均匀分布，其引入的标准不确定度为 g，相对标准不确定度为。

2.2.2 标准物质浓度引入的相对标准不确定度

甲醇中黄曲霉毒素B1标准溶液编号为90107s，浓度为2 μg·mL-1，由标准证书可知相对扩展不确定度为Urel=8%（k=2），因此，标准物质浓度引入的相对标准不确定度为。

2.2.3 标准溶液配制引入的相对标准不确定度

（1）配制标准使用溶液时，使用0.5 mL分度吸量管（A级）吸取标准溶液，使用10 mL单标线容量瓶（A级）定容。根据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[5]，两种玻璃量器的容量允差分别为±0.005 mL、±0.020 mL，玻璃仪器允差引入的不确定度计算公式为；假设实验温差为±5 ℃，水膨胀系数为2.10×10-4 ℃-1，温差变化引入的不确定度计算公式为，玻璃量器引入的标准不确定度为，相对标准不确定度为。两种玻璃量器引入的不确定度结果见表1，该过程引入的相对标准不确定度为。

（2）配制标准系列溶液时，吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和3.0 mL标准中间液分别使用0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL和5 mL分度吸量管（A级），根据JJG 196—2006，6个玻璃量器的容量允差分别为±0.002 mL、±0.003 mL、±0.005 mL、±0.008 mL、±0.012 mL和±0.025 mL，定容使用10 mL单标线容量瓶（A级）6次，玻璃仪器允差与温差引入的不确定度计算公式同上，结果见表1，该过程引入的相对标准不确定度为

综上，标准溶液配制引入的相对标准不确定度为

2.2.4 样液移取定容体积引入的相对标准不确定度

移取提取液20 mL甲醇-水溶液（70+30）使用20 mL单标线吸量管（A级），移取4 mL分取样液使用5 mL分度吸量管（A级），最终待测液定容使用1 mL单标线容量瓶（A级），根据JJG 196—2006，3种玻璃量器的容量允差分别为±0.030 mL、±0.025 mL、±0.010 mL，玻璃仪器允差与温差引入的不确定度计算公式2.2.3，结果见表1，该过程引入的相对标准不确定度为

2.2.5 标准曲线拟合引入的不确定度

将配制的标准系列溶液进行测定，以黄曲霉毒素B1标准溶液浓度（c）为横坐标，相对应测得的色谱峰面积（y）为纵坐标，测试数据见表2，根据表2中数据，基于最小二乘法拟合线性曲线，得到回归方程为y=14 082c-1 107.5，b=14 082，a=-1 107.5。由标准曲线拟合引入的标准不确定度为，其中，n为标准系列溶液测试次数，n=6；由上述公式计算得，sR=408.2815。P为玉米样品测量次数，P=6，玉米样品中黄曲霉毒素B1含量的平均值为7.855 μg·kg-1，代入2.1.1中数学模型计算得c=7.855 ng·mL-1，c=11.333 ng·mL-1，，，由此计算得标准不确定度为u（q）=0.017 19 ng·mL-1，相对标准不确定度为。

2.2.6 测量重复性引入的相对标准不确定度

对某批次抽检的玉米样品在期间精密度条件下进行6次测量，结果分别为8.08 μg·kg-1、7.94 μg·kg-1、7.59 μg·kg-1、7.95 μg·kg-1、7.85 μg·kg-1和7.72 μg·kg-1，测量平均值X为7.855 μg·kg-1，标准偏差s为0.176 3，因此，测量重复性引入的标准不确定度为，其相对标准不确定度为。

2.3 合成与扩展不确定度评定

2.3.1 合成不确定度

黄曲霉毒素B1测定过程中的6个相对不确定度分量互不相关，根据方和根公式计算合成相对标准不确定度为

合成不确定度为

u（X）=urel（X）×X=0.043 4×7.855=0.341 μg·kg-1

2.3.2 扩展不确定度

取包含因子k=2，置信水平为95%时，黄曲霉毒素B1测定过程中的测量扩展不确定度为U=k×u（X）=2×0.341=0.682 μg·kg-1。

2.4 测量不确定度结果

HPLC-柱后光化学衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量为（7.86±0.68）μg·kg-1，k=2。

3 结论

通过分析HPLC-柱后光化学衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的过程，评定影响测量结果的各个不确定度分量发现，标准物质浓度、标准溶液配制与测量重复性引入的不确定度对测量结果的影响较大，样液移取定容体积、称样量及标准曲线拟合对测量结果的影响较小。因此，在检测过程中可以通过使用精度高且允差小的玻璃量器配制标准溶液、选用不确定度小的有证标准物质、适当增加样品测试次数等手段，降低各种不确定度因素对测量结果的影响，提升测量结果的准确性和可信度。

参考文献

[1]尹安胤.免疫亲和柱净化-HPLC光化学柱后衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1的含量[J].现代食品，2021（15）：193-196.

[2]雷欣宇，仲伶俐，李曦，等.UPLC-光化学衍生法测定粮油中黄曲霉毒素[J].粮食与油脂，2022，35（10）：150-153.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定：GB 5009.22—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.

[5]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器：JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.

作者简介：阎安婷（1984—），女，山西长治人，硕士，工程师。研究方向：食品检验检测。