高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉及儿童食品中的防腐剂

摘 要：目的：建立采用高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉及儿童食品中防腐剂的分析方法。方法：样品经水提取，通过蛋白剂沉降，正己烷萃取纯化，高效液相色谱定量分析。结果：脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸在0.5～100.0 mg·L-1线性关系良好，检出限为0.5～1.1 mg·kg-1，定量限为0.9～2.2 mg·kg-1；平均加标回收率在90.1%～109.2%，相对标准偏差在1.2%～4.2%（n=6）。结论：该方法操作简便、准确度高，适用于婴幼儿乳粉及儿童食品中脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的检测。

关键词：高效液相色谱法；防腐剂；婴幼儿乳粉；儿童食品

Determination of Preservatives in Infant Milk Powder and Children’s Food by High Performance Liquid Chromatography

LI Xiaojuan

（Pediatric Department， Longxi Maternal and Child Care Service Centre， Longxi 748100， China）

Abstract： Objective： To establish an analytical method for determining preservatives in infant milk powder and children’s food using high-performance liquid chromatography. Method： The sample was extracted with water， precipitated with a protein agent， purified by n-hexane extraction， and quantitatively analyzed by high-performance liquid chromatography. Result： Dehydroacetic acid， benzoic acid， and sorbic acid showed a good linear relationship between 0.5 mg·L-1 to 100.0 mg·L-1， with a detection limit of 0.5 mg·kg-1 to 1.1 mg·kg-1 and a quantification limit of 0.9 mg·kg-1 to 2.2 mg·kg-1; the average recovery rate of spiked samples ranged from 90.1% to 109.2%， with a relative standard deviation of 1.2% to 4.2% （n=6）. Conclusion： This method is easy to operate， highly accurate， and suitable for the detection of dehydroacetic acid， benzoic acid， and sorbic acid in infant milk powder and children’s food.

Keywords： high performance liquid chromatography method; additives; infant milk powder; children food

食品中添加防腐剂的作用是防止食品变质，延长食品的保质期及保鲜期[1]。食品中适当添加防腐剂对人体健康没有太大影响，但过量摄入则会对身体健康构成威胁。特别地，婴幼儿及儿童肠胃虚弱，摄入过量防腐剂会对胃肠道黏膜产生刺激，引起恶心呕吐等症状，对身体健康造成严重影响[2]。研究表明，脱氢乙酸在食品中的应用有较高的风险，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2024）对食品中脱氢乙酸的使用进行了严格规定，并提出在部分食品中禁止使用脱氢乙酸[3]。部分市售的婴幼儿乳粉及儿童产品宣称“零添加”，为了确认该标识是否属实，有必要对其进行检测。

目前，防腐剂的常用检测方法有气相色谱法（Gas Chromatography，GC）[4]、液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[5]、液相色谱-质谱法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）[6]、气相色谱-质谱法（Gas Chromatography Mass Spectrometry，GC-MS）[7]等。目前，国家标准中针对脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的检测方法不同，存在前处理烦琐、仪器方法不统一、检验周期长等问题，给检验带来不便。本文参考《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）[8]和《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）[9]，进行检测条件优化，采用高效液相色谱法同时测定婴幼儿乳粉及儿童食用产品中脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的含量，以期为婴幼儿乳粉及儿童食用产品中防腐剂的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴幼儿乳粉及儿童食用产品，购自超市、医院、药店、育婴店。

苯甲酸（纯度为99.7%；CAS：65-85-0），中国食品药品检定研究院；山梨酸（纯度为99.7%；CAS：22500-92-1），中国食品药品检定研究院；脱氢乙酸（纯度为99.9%；CAS：520-45-6），曼哈格生物科技有限公司；正己烷、乙腈、乙酸乙酯、丙酮和氯仿，分析纯，成都市科隆化学品有限公司；乙酸锌、亚铁氰化钾，分析纯，上海联试化工试剂有限公司；乙酸铵，分析纯，天津聚恒达化工有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（配DAD二极管阵列检测器），美国安捷伦公司；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国Waters公司；电子天平，美国奥豪斯公司；台式离心机，常州金坛良友仪器有限公司；涡旋振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子天平，赛多利斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

流动相：乙腈-0.02 mol·L-1乙酸铵（10∶90，V∶V），等度洗脱；检测波长：293 nm、230 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流速：1 mL·min-1。

1.3.2 标准溶液的配制

用移液管取苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸标准溶液（浓度均为1 000 mg·L-1）0.5 mL，用水配制成50 mg·L-1的混合标准液。再用婴幼儿乳粉空白基质配制成浓度为0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1的系列混合标准工作溶液。

1.3.3 样品前处理

准确称取样品5.0 g，置于50 mL塑料离心管中，加水10 mL，再加2 mL乙酸锌溶液（183 g·L-1）和2 mL亚铁氰化钾（92 g·L-1），加水至25 mL，涡旋振荡5 min，加入5 mL正己烷，涡旋振荡5 min，8 000 r·min-1离心5 min，取下层水层过0.22 μm滤膜，供检测。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化

在市售的婴幼儿乳粉和儿童食品中，儿童果汁、儿童酱油等液体样品的蛋白质和脂肪含量低，脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸提取容易；但对于蛋白质和脂肪含量较高的产品，如婴幼儿乳粉及含乳食品奶片、儿童乳酪、儿童有机核桃油和婴幼儿辅食等，因待测组分包裹在样品中，如果不除去大量蛋白质和脂肪，提取时会出现乳化和待测物提取不完全的现象。而脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸在水中溶解性较好，故本实验在样品前处理中先加入10 mL水，使样品分散，再用有机试剂除去脂溶性杂质，释放出游离态脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸。

本文研究过程中考察了乙酸乙酯、丙酮、正己烷对婴幼儿乳粉中脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的提取效果，以加标浓度50 mg·L-1的待测物在婴幼儿配方乳品中的回收率为考察指标，对比乙酸乙酯、丙酮、正己烷和氯仿对脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的提取效果。结果表明，正己烷萃取效果最佳，见图1。

2.2 色谱条件优化

对色谱条件进行了优化，发现按1.3.1项色谱条件进样，婴幼儿配方乳品和儿童食品中的脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸能完全分离，相邻色谱峰分离度大于2.0，理论板数大于10 000，干扰小。详见图2。

2.3 标准曲线、检出限和定量限

按1.3.2项方法配制系列混合标准工作溶液，经液相色谱仪检测，以峰面积（Y）为纵坐标，以脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，得到的线性方程及相关系数如下。脱氢乙酸：Y=0.034X-0.020，r2=0.999 2；苯甲酸：Y=3.17X+0.036，r2=0.999 0；山梨酸：Y=5.22X+0.019，r2=0.999 1。各目标物质在线性范围内线性关系良好，相关系数r2均＞0.99。

以3倍信噪比（S/N）对应的质量浓度为检出限，以10倍信噪比（S/N）对应的质量浓度为定量限，得出脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的检出限为0.5～1.1 mg·kg-1，定量限为0.9～2.2 mg·kg-1，能够满足婴幼儿配方乳粉和儿童食品中脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的定量分析[3]。

2.4 回收率和精密度

依次在婴幼儿配方乳粉和儿童食品空白基质中加入0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1的混合标准溶液，分别平行测定6次，进行加标回收实验，结果见表1。在3个添加水平下，本方法对应的脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的平均回收率在90.1%～109.2%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为1.2%～4.2%（n=6），优于国家标准方法[8-9]，表明本方法适用于婴幼儿配方乳粉和儿童食品中脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸的提取和净化，方法的准确度和精密度均满足定量分析要求。

2.5 实际样品测定

抽取市场上不同婴幼儿配方乳粉和儿童食品样品35批次，采用本方法进行检测。结果显示，2份儿童酱油样品中测出防腐剂山梨酸，2份样品检出脱氢乙酸（分别是婴儿辅食饼干和儿童肉肠）；2份样品防腐剂超标，分别是儿童酱油（山梨酸超标）和儿童奶酪棒（脱氢乙酸超标），山梨酸和脱氢乙酸的超标率均为2.9%；其他样品均未检出脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸。

3 结论

本研究采用高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉及儿童食品中的防腐剂含量，并对前处理方法及检测条件进行了优化。结果表明，该方法前处理简单，仅需要简单溶解和萃取，检测结果提取回收率高、分离效果好，能满足婴幼儿配方乳粉和儿童食品中脱氢乙酸、苯甲酸和山梨酸含量的测定要求。

参考文献

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[8]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定：GB 5009.121—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[9]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定：GB 5009.28—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.