液相色谱-串联质谱法测定乳品中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量

摘 要：目的：建立液相色谱-串联质谱法测定乳品中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的方法。方法：乳品试样用2%氨化乙酸乙酯溶液提取，经正己烷脱脂，再用2%氨化乙酸乙酯溶液反萃取，浓缩过膜后上机测试。结果：氟苯尼考和氟苯尼考胺在1～50 μg·L-1线性关系良好，检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1 μg·kg-1，加标回收率为82.5%～100.4%，RSD为3.35%～6.98%。结论：该方法适用于乳品中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的定性、定量分析。

关键词：液相色谱-串联质谱法；乳品；氟苯尼考；氟苯尼考胺

Determination of Flufenicol and Flufenicol Amine Residues in Dairy Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XU Shuran

（Shenzhen Academy of Metrology & Quality Inspection， Shenzhen 518000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of flufenicol and flufenicol amine residues in dairy products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： Milk samples were extracted with 2% ethyl acetate solution， defatted with n-hexane， then back extracted with 2% ethyl acetate solution， concentrated and tested by machine. Result： The linear relationship between flufenicol and flufenicol amine  was good in the range of 1～50 μg·L-1. The limit of detection was 0.5 μg·kg-1， the limit of quantitation was 1 μg·kg-1， the recoveries were 82.5% to 100.4%， and the RSD was 3.35% to 6.98%. Conclusion： The method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of flufenicol and flufenicol amide residues in dairy products..

Keywords： liquid chromatography-tandem mass spectrometry; dairy food; flufenicol; flufenicol amide

氯霉素类药物包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（Flufenicol，FF）等，常用来治疗牲畜和家禽的细菌性呼吸系统与肠道系统感染，疗效很好[1]。在氯霉素因损害人体造血系统，相继被欧盟和我国列入动物源性产品禁用名单后，氟苯尼考凭借其抗菌效果相当、价格便宜、毒副作用小等优势，成为氯霉素的替代品，被大量用于牲畜饲养、家禽养殖中预防和治疗疾病。然而，经研究表明氟苯尼考在畜禽体内具有胚胎毒性，人体长期摄入氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺（Flufeni colamide，FFA）也会对健康产生威

胁[2-4]。近年来，我国乳品行业发展迅速，产量和总产值增长在10倍以上，乳制品消费市场前景广阔。然而，在奶牛养殖过程中也会使用到FF等氯霉素类药物。如果养殖企业违规使用抗生素或不按规定执行休药期，就会导致乳品中FF和FFA残留，影响消费者健康。因此，本研究参照《食品安全国家标准 动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31658.20—2022）[5]，建立了液相色谱-串联质谱法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS）测定乳品中FF及FFA残留量的分析方法，旨在为奶牛养殖或乳品生产企业加强品控、检验检测机构加强监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

某品牌纯牛奶，购自某超市。

甲醇中FF/FFA混标[编号GBW（E）083592，浓度为100 mg·L-1]，中国农业科学院；甲醇中FF-D3（编号91884a，浓度为100 μg·mL-1）、甲醇中FFA-D3（编号91854a，浓度为100 μg·mL-1），均购自坛墨质检科技股份有限公司；甲醇、乙腈，美国赛默飞公司；乙酸乙酯、正己烷（色谱纯），德国默克公司；氨水（分析纯），山东星菲化学有限公司；无水硫酸钠、氯化钠、甲酸铵（分析纯），天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantis高效液相色谱质谱联用仪，美国赛默飞公司；GL2202-1SCN分析天平（精度0.01 g），德国赛多利斯公司；HT190R高速台式冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HSC-B水浴氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司；Multi Reax多管旋涡振荡器，德国海道尔夫公司；VORTEX MS3涡旋混合仪，德国艾卡公司。

1.3 标准系列溶液配制

（1）混合标准中间液（5 μg·mL-1）。准确吸取0.5 mL浓度为100 mg·L-1的甲醇中FF/FFA混标于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，配制成FF/FFA混合标准中间液。

（2）混合内标中间液（5 μg·mL-1）。分别吸取0.5 mL浓度为100 μg·mL-1的甲醇中FF-D3、甲醇中FFA-D3于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，配制成FF-D3与FFA-D3混合内标中间液。

（3）混合内标工作液（50 μg·L-1）。准确吸取0.1 mL浓度为5 μg·mL-1的FF-D3与FFA-D3混合内标中间液于10 mL容量瓶中，用20%甲醇溶液稀释定容至刻度，配制成FF-D3与FFA-D3混合内标工作液。

（4）混合标准工作系列溶液。分别吸取2 μL、5 μL、10 μL、20 μL、50 μL和100 μL浓度均为5 μg·mL-1的FF与FFA混合标准中间液于6个10 mL容量瓶中，再向各容量瓶中加入1.0 mL浓度为50 μg·L-1的FF-D3与FFA-D3混合内标工作液，用20%甲醇溶液稀释定容至刻度，配制成浓度均为1.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、25.0 μg·L-1和50.0 μg·L-1的FF与FFA混合标准工作系列溶液，FF-D3与FFA-D3浓度均为5 μg·L-1的混合标准工作系列溶液。

1.4 试样处理

称取2 g（精确至0.01 g）混匀的乳品试样于50 mL离心管中，加入100 μL混合内标工作液，涡旋混匀，再加入10 mL 2%氨化乙酸乙酯溶液、3 g无水硫酸钠，置于多管旋涡振荡器上涡旋振荡10 min，使用8 000 r·min-1冷冻离心机离心5 min，将离心后的上清液转移入另一支离心管中，在残渣中加入10 mL 2%氨化乙酸乙酯溶液，重复涡旋提取一次，离心，合并两次上清液，置于水温50 ℃的氮吹仪上吹干，待净化。

向待净化的残渣中加入3 mL 4%氯化钠溶液，涡旋使残渣溶解。加入5 mL 4%氯化钠饱和的正己烷，涡旋混匀，使用8 000 r·min-1冷冻离心机离心5 min，弃去上层溶液，再重复脱脂一次。加入5 mL 2%氨化乙酸乙酯溶液，置于多管旋涡振荡器上涡旋振荡5 min，使用8 000 r·min-1冷冻离心机离心5 min，取上层有机相，重复萃取一次，合并两次萃取后的有机相，置于水温50 ℃的氮吹仪上吹干，加入1.0 mL 20%甲醇溶液复溶，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.5 仪器分析条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样量：1 μL；流动相：0.1%甲酸水（A）+乙腈（B）；梯度洗脱程序：0～0.5 min、90%A+10%B，0.5～2.0 min、90%A+10%B，2.0～3.5 min、5%A+95%B，3.5～3.6 min、90%A+10%B，3.6～5.0 min、90%A+10%B。

1.5.2 质谱测试条件

电离方式：电喷雾电离；离子源：FF与FF-D3为ESI-，FFA与FFA-D3为ESI+；扫描方式：多反应监测；毛细管电压：3 500 V；离子源温度：350 ℃；鞘气压力：45 Arb；辅助气压力：10 Arb；监测离子（m/z）：FF 356.0＞185.0、356.0＞219.0（定性），356.0＞336.0（定量）；FFA 356.0＞219.0、248.0＞130.0（定性），248.0＞230.0（定量）；FF-D3 359.2＞339.0（定性），359.2＞339.0（定量）；FF-D3 251.2＞233.1（定性），251.2＞233.1（定量）。

2 结果与分析

2.1 方法的线性关系

将配制的混合标准工作系列上机测定，以混合标准工作系列中FF和FFA的浓度为横坐标，相对应测得的定量离子峰与内标峰面积之比为纵坐标，绘制标准工作曲线，由仪器配置的工作站自动计算线性方程与相关系数。由表1可知，FF和FFA在1～50 μg·L-1，线性关系良好，相关系数R2均大于0.99，满足相关标准对线性的要求。

2.2 方法的检出限与定量限

称取2 g纯牛奶阴性样品，添加50 μL FF和FFA浓度均为50 μg·L-1的混合标准溶液，按照1.4试样处理过程进行试样前处理，在1.5仪器分析条件下分析测定，以FF和FFA测得定量离子峰面积与基线的信噪比S/N≥3对应的浓度来确定方法的检出限，以信噪比S/N≥10对应的浓度来确定方法的定出限。结果表明，FF和FFA的检出限均为0.5 μg·kg-1，定量限均为1 μg·kg-1，检出限与定量限均符合方法标准GB 31658.20—2022中灵敏度的要求。

2.3 加标回收率及精密度

选择阴性纯牛奶为加标样品，按照1倍、2倍、10倍定量限对应的含量，分别添加低（1 μg·kg-1）、中（2 μg·kg-1）、高（10 μg·kg-1）3个浓度水平的FF/FFA混合标准溶液，按照1.4试样处理过程进行试样前处理，在1.5仪器分析条件下分析测定，加标试样的各个浓度水平均平行测定6次，计算加标回收率与相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表2可知，FF加标回收率为82.5%～95.1%，RSD为3.79%～5.22%；FFA加标回收率为85.6%～100.4%，RSD为3.35%～6.98%，回收率与精密度符合GB 31658.20—2022关于准确度和精密度的要求。

3 结论

本研究参照GB 31658.20—2022，建立了LC-MS法测定乳品中FF及其代谢物FFA残留量的分析方法，FF和FFA在1～50 μg·L-1线性关系良好，检出限均为0.5 μg·kg-1，定量限均为1 μg·kg-1，加标回收率在82.5%～100.4%，RSD在3.35%～6.98%，可以为乳品中FF及其代谢物FFA残留量提供确证方法，有助于检验检测机构加强乳品中兽药残留的监控能力。

参考文献

[1]郑陆红，张慧琼，陈茹，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物组织中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和其代谢产物氟苯尼考胺残留量[J].现代食品，2022，28（20）：198-203.

[2]卜宁霞，陈娟，李永琴，等.鸡蛋中酰胺醇类药物及其代谢物残留检测超高效液相色谱-串联质谱法建立[J].药物分析杂志，2022，42（9）：1625-1633.

[3]辛晓晨，卫瑾瑾，鹿尘，等.通过式固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留[J].中国食品卫生杂志，2023，35（9）：1297-1303.

[4]刘迪，王会霞，黄坤，等.同位素稀释-液相色谱-串联质谱法测定肉制品中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留[J].中南农业科技，2024，45（7）：58-62.

[5]中华人民共和国农业农村部，中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法：GB 31658.20—2022[S].北京：中国农业出版社，2022.

作者简介：徐舒然（1995—），女，广东深圳人，本科。研究方向：食品安全问题。