QuEChERS结合超高效液相色谱串联质谱法测定蔬菜中四环素类抗生素

摘 要：本文建立了QuEChERS结合超高效液相色谱串联质谱测定蔬菜中3种四环素类抗生素的方法。方法学分析发现，四环素质量浓度在2～200 ng·mL-1时，土霉素、金霉素质量浓度在1～200 ng·mL-1时，线性关系良好，线性系数均大于0.995。四环素、土霉素和金霉素的检出限分别为0.8 μg·kg-1、0.4 μg·kg-1、0.4 μg·kg-1，定量限分别为2.6 μg·kg-1、1.3 μg·kg-1、1.3 μg·kg-1。各目标化合物的回收率为64.5%～92.6%，相对标准偏差为1.8%～10.9%。表明本方法灵敏度高、操作简单，适用于蔬菜中3种四环素类抗生素的快速检测。

关键词：蔬菜；超高效液相-串联质谱法；四环素类抗生素

Determination of Tetracycline Antibiotics in Vegetables by QuEChERS Combined with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GU Mantun1， WANG Xiang2， GUO Xiaoyu1， LIN Zhifan1， KANG Rui1*

（1.Institute of Food Testing， Hainan Academy of Inspection and Testing， Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety， State Administration for Market Regulation， Haikou 570100， China;

2.School of Tropical Medicine， Hainan Medical University， Haikou 571199， China）

Abstract： In this paper， a method for the determination of three tetracycline antibiotics in vegetables by QuEChERS combined with ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was established. Methodological analysis showed that when the mass concentration of tetracycline was 2 ng·mL-1 to 200 ng·mL-1， the mass concentration of oxytetracycline and chlortetracycline were 1 ng·mL-1 to 200 ng·mL-1， the linear relationship was good， and the linear coefficients were greater than 0.995. The limits of detection of tetracycline， oxytetracycline and aureomycin were 0.8 μg·kg-1， 0.4 μg·kg-1 and 0.4 μg·kg-1， and the limits of quantitation were 2.6 μg·kg-1， 1.3 μg·kg-1 and 1.3 μg·kg-1， respectively. The recoveries of the target compounds were 64.5% to 92.6% and the relative standard deviations were 1.8% to 10.9% The results indicated this method is sensitive and easy to operate， which is suitable for the rapid determination of there tetracycline antibiotics in vegetables.

Keywords： vegetables; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; tetracycline antibiotics

四环素类抗生素（Tetracyclines，TCs）包括四环素、土霉素、金霉素等，是由放线菌产生的一类抗生素。TCs具有良好的广谱性、稳定性，且价格低廉，被广泛添加至饲料中以预防动物疾病和促进动物生长[1]。由于其在动物体内不能被完全分解，部分会经消化道随排泄物排出体外[2]，这些畜禽废物被用作有机肥施入土壤中，造成土壤污染，而土壤中种植的蔬菜等农作物可能会吸收累积TCs，最终经过食物链对人体健康造成不良影响，主要包括肠道菌群失调、过敏、器官病变、牙齿发黄变黑等[3]。近年来，多有研究报道在蔬菜中检测出不同污染程度的TCs。姚圆等[4]在检测瓜果类、叶菜类及块根类等9类蔬菜中的四环素类抗生素时发现，除冬瓜外，其他蔬菜中均检出四环素和土霉素。然而，目前我国还未制定蔬菜中TCs残留限量以及检测方法相关标准，因此探究蔬菜中TCs的检测方法十分必要。

常见的前处理方法包括微波辅助提取法、超临界流体萃取法、固相萃取法以及QuEChERS法等。其中，QuEChERS法是一种新型的前处理方法，具有快速、简单、廉价、有效、可靠和安全的优点，近年来被广泛用于农兽药残留检测中。常用的食品中农兽药残留检测方法有分光光度法、酶联免疫吸附法、液相色谱法以及超高效液相色谱串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）等[5]。其中，UPLC-MS/MS具有快速、适用性广、高灵敏度及高准确性等优点，被广泛应用在TCs的检测中。本文参考四环素类抗生素已有的提取、净化方式，建立一种基于QuEChERS前处理技术的蔬菜中TCs的UPLC-MS/MS测定方法，旨在为评估蔬菜中TCs污染状况提供技术支撑，同时为开发蔬菜中四环素类抗生素的新型检测方法提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蔬菜，购于海南海口当地菜市场。

甲酸（质谱级），美国ACS公司；乙腈、甲醇（质谱级），德国Merck公司；盐酸四环素标准物质（纯度98.4%）、盐酸金霉素标准物质（纯度94.1%）、土霉素标准物质（纯度88.8%），中国食品药品检定研究院；乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠（分析纯），广州化学试剂厂；实验室用水为Milli-Q制备超纯水。

1.2 仪器与设备

Multi ReaX涡旋振荡器，德国Heidolph公司；SK7200B超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；5804 R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Xcelvap氮吹仪，美国Horizon公司；XS204万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；Xevo TQ-XS超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，美国Waters公司；Milli-Q IQ7000超纯水机，德国Merck公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

0.1 mol·L-1 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：称取乙二胺四乙酸二钠37.2 g、磷酸氢二钠10.9 g、柠檬酸12.9 g，加少量水混合均匀后转移至1 000 mL容量瓶中，继续加水定容至刻度线，用0.1 moL·L-1盐酸溶液调pH=4.0±0.05。

分别精密称取一定量的3种标准物质，用甲醇溶解配制成浓度分别为100.0 μg·mL-1的土霉素、四环素和金霉素标准储备液。各取1 mL土霉素、四环素和金霉素标准储备液于100 mL容量瓶中，添加甲醇定容至刻度线，配制成浓度为1.0 μg·mL-1的混合标准中间液。再用甲醇将混合标准中间液稀释10倍，得到浓度为0.1 μg·mL-1的混合标准溶液。

1.3.2 样品处理

称取粉碎均匀的蔬菜样品5 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，涡旋1 min后超声15 min，再加入20 mL 0.1%甲酸-乙腈混合溶液，涡旋5 min，在10 000 r·min-1、4 ℃条件下离心5 min。离心结束后，取上清液移至干净的50 mL离心管中，加入无水硫酸钠5 g，涡旋2 min，在10 000 r·min-1、4 ℃条件下离心3 min。取10 mL上层液体转移至干净的15 mL离心管中，向其中加入300 mg C18粉末，涡旋2 min后，在10 000 r·min-1、4 ℃下离心3 min，再将上层液体全部转至另一干净的15 mL离心管中。放入氮吹仪，在40 ℃条件下，氮吹至近干。用初始比例的流动相定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜，待上机。

1.3.3 基质标准曲线的制备

精密吸取不同体积的混合标准溶液和混合标准中间液，依次加入7份经净化处理后的空白样液中，氮吹至近干，用初始比例的流动相定容至1 mL，配制成浓度分别为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1及200 ng·mL-1的系列标准工作溶液。

1.3.4 仪器条件

（1）液相条件。色谱柱：Waters ACQUITY-UPLC®BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；流速：0.2 mL·min-1；进样体积：2 μL。洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～0.5 min，10%B；0.5～4.0 min，10%→30%B；4.0～4.5 min，30%B；4.5～5.0 min，30%→10%B；5.0～6.0 min，10%B。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；去溶剂温度：500 ℃；毛细管电压：0.5 kV；锥孔电压：65 V；以氮气为保护气，氩气为碰撞气。

1.3.5 数据处理

采用液质联用仪自带的MassLynx V4.2.lnk软件对采集的原始数据进行处理，并用Excel 2013进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

为获得最佳的质谱参数，本实验进行一级质谱扫描，得到目标物的母离子，再调整优化碰撞能量，得到稳定性好的子离子。优化后的质谱参数见表1。

2.2 前处理条件优化

研究乙腈、0.1%的甲酸-乙腈对白菜中四环素类抗生素的提取效果，发现目标物质的回收率低于10%，提取效果较差，无法满足相关要求。因此，本文参照欧亚红[6]研究方法和《食品安全国家标准 水产品中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量的测定》（GB 31656.11—2021）中四环素类的提取方法，发现选用0.1 mol·L-1 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液和0.1%甲酸-乙腈作为蔬菜中四环素类的提取剂时，回收率能够达到要求。

考察超声时间（5 min、10 min、15 min和20 min）以及加入酸化乙腈后的涡旋时间（5 min、10 min、15 min）对目标物质回收率的影响，发现当超声时间为15 min、涡旋时间为5 min时，既能保证目标物质有较高的回收率，又能节省提取时间。C18因能吸附蔬菜中的色素、有机酸等物质，常被用作蔬菜中农兽药残留检测的净化剂[7]。本文比较了不同加入量的C18（50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、300 mg和500 mg）对白菜提取液的净化效果，结果发现加入300 mg C18时，回收率最佳。

综上，本研究选用0.1 mol·L-1 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液和0.1%甲酸-乙腈作为提取剂，按照超声时间为15 min、涡旋时间为5 min以及C18加入量为300 mg进行后续实验。