超高效液相色谱串联质谱法测定海参中硝基呋喃类代谢物残留量

摘 要：目的：建立一种快速、准确、高效的超高效液相色谱串联质谱检测海参中硝基呋喃类代谢物残留量的方法。方法：采用40 ℃水浴中超声1 h，45 ℃气浴中衍生5 h，pH值7.0～7.5条件进行样品前处理，以2 mmol·L-1乙酸铵的0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，超高效液相色谱串联质谱测定。结果：4种硝基呋喃类代谢物在0.5～20.0 ng·mL-1线性关系良好，加标平均回收率在97.3%～103.6%，方法检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1.0 μg·kg-1。结论：该方法可用于市售海参中硝基呋喃类代谢物残留量的快速检测。

关键词：海参；硝基呋喃类代谢物；超高效液相色谱串联质谱法

Determination of Nitrofuran Metabolites in Sea Cucumber by Ultra-high Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

NING Chen

（Ningde Quality Inspection Institute of Product， Ningde 352100， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid， accurate， and efficient method for detecting residual nitrofuran metabolites in sea cucumber using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Method： Sample pretreatment was carried out using ultrasound for 1 hour in a 40 ℃ water bath， derivatization for 5 hours in a 45 ℃ gas bath， and pH values ranging from 7.0 to 7.5. Gradient elution was performed using a mobile phase of 2 mmol·L-1 ammonium acetate in 0.1% formic acid aqueous solution acetonitrile， and ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used for determination. Result： The four nitrofuran metabolites showed a good linear relationship in the range of 0.5 ng·mL-1 to 20.0 ng·mL-1， with an average recovery rate of 97.3% to 103.6%. The detection limit of the method was 0.5 μg·kg-1， and the quantification limit was 1.0 μg·kg-1. Conclusion： This method can be used for rapid detection of residual nitrofuran metabolites in commercially available sea cucumbers.

Keywords： sea cucumber; nitrofuran metabolites; ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

海参作为一种富含多种人体必需营养成分的海洋产品[1-2]，随着人们生活水平的提高，已逐渐成为普通家庭餐桌上的常见美食。然而，在海参养殖过程中，为防止出现病害，常使用全池泼洒法进行水体消毒[3]。硝基呋喃类药物是常用的一种杀菌剂，其具有抗菌谱广、效果明显且价格便宜等优势，被海参养殖户广泛用于预防在养殖过程中出现的病害[4-5]。

硝基呋喃药物的残留物可能通过食物链进入人体，对健康构成潜在风险[6-7]。目前，中华人民共和国农业农村部公告第250号（食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单）规定，硝基呋喃类药物属于禁用兽药，在海参等水产品中不得检出。因此，加强对硝基呋喃类代谢物等兽药残留的检测，是保障水产品质量安全的重要措施。

现行国家标准在检测海参中的硝基呋喃类代谢物时，通常采用液相色谱-串联质谱法，包括进行酸解、衍生、净化等前处理步骤，检测周期较长，通常需要1～2 d[8-10]。而快检方法又存在假阳性的风险，难以满足海参交易中的检测需求[11-12]。因此，建立一种可快速出具结果的检测方法，显得至关重要。本文旨在研究一种快速、准确、高效检测海参中硝基呋喃类代谢物的方法，为水产品质量安全与行业发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙酸乙酯、乙腈、甲醇和乙酸铵，均为色谱纯；2-硝基苯甲醛为优级纯；浓盐酸、无水磷酸氢二钾，均为分析纯。

标准品：3-氨基-2-恶唑烷基酮（AOZ，纯度99.14%，CAS NO.80-65-9）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ，纯度99.19%，CAS NO.43056-63-9）、1-氨基-2-内酰脲盐酸盐（AHD·HCl，纯度99.90%，CAS NO.2827-56-7）和氨基脲盐酸盐（SEM·HCl，纯度99.77%，CAS NO.563-41-7），均购自Dr.Ehrenstorfer公司。

内标：AOZ-D4（纯度99.7%，CAS NO.1188331-23-8）、AMOZ-D5（纯度98.0%，CAS NO.1017793-94-0）、AHD-13C3（纯度98%，CAS NO.957509-31-8）和SEM·HCl-13C，15N2（不确定度±3%，k=2，CAS NO.1173020-16-0），均购自BePure公司。

以日常检测积累的海参阳性样品作为测试样，选取了3个阳性样品（样品1、样品2、样品3）。其中，样品1为含AOZ和AHD的海参阳性样品，AOZ和AHD的含量分别为10.2 μg·kg-1和4.1 μg·kg-1；样品2为含SEM的海参阳性样品，SEM的含量为19.9 μg·kg-1；样品3为含AMOZ的海参阳性样品，AMOZ的含量为3.5 μg·kg-1。

1.2 仪器与设备

Agilent LC1290-G6460A液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）；VORTEX-5涡旋振荡器，海门其林贝尔；JZQ-Ⅱ均质器，天津津德；TGL-15B高速离心机，上海安亭；ZD-85气浴恒温振荡器，常州国华电器；SE812氮吹仪，北京帅恩；KQ-500DE超声波清洗器，昆山超声仪器。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

混合标准储备液（1.0 mg·mL-1）：精确称量AOZ、AMOZ、AHD和SEM标准品各0.010 0 g于10 mL容量瓶中，加1 mL纯水溶解，用乙腈定容。

混合内标储备液（10.0 μg·mL-1）：精确移取AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C，15N2内标物各100 μL，加900 μL乙腈。

标准工作溶液：空白海参样品按照样品前处理步骤进行衍生、萃取得下清液，准确移取适量4种硝基呋喃类代谢物混合标准中间溶液（100 ng·mL-1），用下清液稀释得到浓度为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的标准工作溶液。同时，准确移取适量的100.0 ng·mL-1硝基呋喃内标工作溶液，使得标样中最终内标浓度为5.0 ng·mL-1。

1.3.2 样品前处理

称取已均质的海参样品2.0 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，准确加入100 μL混合内标工作液（100.0 ng·mL-1），加入0.5 mol·L-1的盐酸溶液5.0 mL和0.1 mol·L-1的2-硝基苯甲醛溶液200 μL，涡旋混合10 min，于超声波清洗器中40 ℃水浴超声1 h，然后置于气浴恒温振荡器中，45 ℃避光衍生5 h。

取出已衍生的样品，冷却至室温，缓慢加入1.0 mol·L-1的K2HPO4溶液，调节溶液的pH值为7.0～7.5，加入乙酸乙酯20.0 mL萃取，低速涡旋混合30 s，平行振荡10 min后，于高速离心机中10 000 r·min-1离心5 min。取上清液至氮吹管中，放入氮吹仪40 ℃水浴中氮气吹干（在氮吹过程中，应留意提取液是否被吹干，若已干应及时取出氮吹管，否则会影响测定结果）。移取2.0 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液（1+9，V+V）加入已干的氮吹管中，再加入2.0 mL乙腈饱和的正己烷，低速涡旋溶解残留物，以10 000 r·min-1离心10 min，下清液过有机系尼龙过滤器（0.22 μm，13 mm）至进样瓶，供液相色谱-串联质谱仪检测。

1.3.3 液相色谱和质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL·min-1；流动相A：含2 mmol·L-1乙酸铵的0.1%甲酸水溶液，B：乙腈。洗脱条件：0～0.6 min，10%→20%B；0.6～3.0 min，20%B；3.0～6.0 min，20%→25%B；6.0～7.0 min，25%→60%B；7.0～8.0 min，60%→95%B；8.0～10.0 min，95%B；10.0～10.1 min，95%→10%B；10.1～12.0 min，10%B。

（2）质谱条件。电喷雾离子源类型：ESI+；干燥气温度：325 ℃；干燥气流量：10 L·min-1；鞘气温度：350 ℃；鞘气流量：12 L·min-1；雾化器压力：45 psi；毛细管电压：4 500 V。4种硝基呋喃类代谢物质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件优化

2.1.1 超声时间优化

超声提取是一种在较低温度下进行的高效、适用性广的前处理技术[13-14]。为进一步优化超声时间，本研究固定1.3.2的样品前处理条件，探究超声时间0 h、0.5 h、1.0 h和2.0 h对4种硝基呋喃类代谢物回收率的影响。由图1可知，超声时间1 h时，4种硝基呋喃类代谢物的回收率达到100%，而当超声时间超过1 h时，AOZ、AHD提取效率不受影响，SEM、AMOZ提取效率呈下降趋势，因此，本研究选择最佳超声时间为1 h。

2.1.2 衍生时间优化

固定1.3.2的样品前处理条件，探究衍生时间0 h、2 h、3 h、4 h和5 h对4种硝基呋喃类代谢物回收率的影响。由图2可知，随着衍生时间的延长，4种硝基呋喃类代谢物的回收率均呈上升趋势，当衍生时间为5 h时，AOZ、AHD、SEM和AMOZ的回收率均达到100%。因此，本研究选择最佳衍生时间为5 h。

2.1.3 衍生温度优化

固定1.3.2的样品前处理条件，探究衍生温度37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和60 ℃对4种硝基呋喃类代谢物回收率的影响。由图3可知，衍生温度在45 ℃时，AOZ、AHD、SEM和AMOZ的回收率均达到100%，但当衍生温度继续升高时，SEM、AMOZ的回收率呈现下降趋势，这可能是由于温度升高会引起SEM、AMOZ这2种代谢物的降解。因此，本研究选择最佳衍生温度为45 ℃。